王曉路 劉桂珍 黃立嵩 陳紅巖 王東彬 張 勇 黎 瑋

前列腺癌是中老年男性最常見的腫瘤之一，晚期雄激素非依賴性前列腺癌是治療的難點。該病的發(fā)病原因迄今仍不十分清楚。雄激素在前列腺的生長、轉(zhuǎn)移與分化中起決定性作用，而其中雄激素受體(androgen receptor，AR)是雄激素發(fā)揮作用的中心環(huán)節(jié)。5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-dC)是1種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，能夠特異抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1、3a、3b的活性，從而降低基因組DNA甲基化水平[1]。5-Aza-dC能夠抑制腫瘤細胞的增殖和誘導腫瘤細胞凋亡，但5-Aza-CdR是否對前列腺癌細胞中雄激素受體(androgen receptor，AR)的表達有影響目前研究較少。本研究以人雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細胞株為研究對象，建立裸鼠背部皮下移植瘤模型，檢測5-Aza-CdR對前列腺癌腫瘤的生長抑制作用及對AR基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人雄激素依賴性前列腺癌細胞株LNCaP細胞購自中國醫(yī)學科學院細胞中心，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司；5-AZA-CdR購自美國Sigma公司，溶于二甲基亞砜(DMSO)中制備成10 mg/ml的母液，-80℃儲存。6周齡雄性BALB/c裸鼠，體量18～20 g，購于中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。小鼠游離性前列腺特異性抗原(free prostate specific antigen，F(xiàn)PSA) ELISA試劑盒購自美國R&D公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成?？俁NA抽提試劑TRIZOL購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，SYBR Green PCR Master Mix購自Toyobo公司。熒光定量PCR儀為ABI公司的7900實時熒光定量PCR儀。AR抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人前列腺癌LNCaP細胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃、飽和濕度和5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。當細胞處于對數(shù)生長期時，用0.25%胰蛋白酶消化后傳代。

1.2.2 動物實驗動物移植瘤模型的建立 當細胞處于對數(shù)生長期時，用胰酶消化后收集，用生理鹽水洗3次，制成單細胞懸液，臺盼藍染色計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5×107個/ml，每次取0.1 ml，與細胞基質(zhì)Matrigel混合后，皮下注射裸鼠的肋腹部，待腫瘤體積長至為300 mm3時，將LNCaP荷瘤裸鼠隨機分成2組，每組10只。治療組給予5-Aza-CdR、0.25 mg/kg腹腔注射，每2天給藥1次。對照組予生理鹽水腹腔注射，每3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積(長徑×短徑2×0.5)，繪制移植瘤生長曲線。觀察24 天后，摘眼球取血，離心取上清檢測血清PSA水平。處死所有裸鼠，取出腫塊測量腫瘤重量，計算抑瘤率，抑瘤率(%)=(對照組平均瘤重-5-Aza-CdR組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。用手術刀把瘤塊分成兩部分，一部分用于抽提RNA，另一部分用于抽提蛋白質(zhì)。

1.2.3 實時定量PCR檢測AR mRNA的表達水平 采用Trizols法提取腫瘤組織總RNA(按說明書操作)，紫外分光計鑒定RNA的濃度和純度，取比值為1.8～2.0的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。以合成的cDNA為模板，進行real time PCR檢測。AR上游引物： 5’-CATCCTGCTCAAGACGCTTC-3’；下游引物：5’-CACAGAGATGATCTCTGCCA-3’。GAPDH上游引物：5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’； GAPDH下游引物：5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’。反應步驟如下：95℃ 5 min；40個PCR循環(huán)(95℃ 10 s；60℃ 20 s；72℃ 30 s)。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法分析[2]。

1.2.4 WesternBlot檢測AR蛋白質(zhì)的表達水平 腫瘤組織用冰冷的PBS 液沖洗3次，加RIPA 細胞裂解液裂解細胞并提取總蛋白，BCA法定量總蛋白，進行SDS-PAGE(5% 濃縮膠，10% 分離膠)，各泳道上樣量為50 μg。取下凝膠將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，用PBST(PBS-Tween20)溶液洗滌10 min 后， 加5%脫脂奶粉封閉2 h； 用PBST 洗滌2 次，5 min/次；加1∶1 000 稀釋的抗AR抗體，4 ℃培育過夜，PBST 洗滌3 次，10 min/ 次；加1∶2 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，PBST 洗滌3 次，10 min/ 次；加化學超敏發(fā)光試劑曝光于膠片上，應用Totallab 圖像分析軟件進行蛋白條帶灰度值測定，以目的條帶的灰度值/GAPDH 條帶的灰度值，該比值表示AR蛋白的相對表達量。實驗重復3 次。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR對LNCaP人前列腺癌裸鼠移植瘤生長的影響

LNCaP細胞裸鼠皮下接種6周后,肉眼可見米粒大小的腫瘤，8周后移植瘤平均體積約為300 mm3左右。給予5-Aza-CdR治療后，裸鼠腫瘤體積逐漸增大，至治療后的第14天，該組腫瘤增長速度較對照組明顯變緩，至治療后的第24天，對照組腫瘤體積從最初的(278±21)mm3增大到(1 867±195)mm3，5-Aza-CdR治療組腫瘤體積從治療初的(294±42)mm3增大到(982±83)mm3，腫瘤生長受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖1)。第24天實驗結(jié)束時，5-Aza-CdR治療組移植瘤重量與對照組比較明顯下降，5-Aza-CdR組腫瘤重量為(796±178)mg，對照組為(1 267±252)mg，抑瘤率為37.2%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2)，說明5-Aza-CdR對前列腺癌LNCaP裸鼠移植瘤的生長具有顯著抑制作用。

圖1 5-Aza-CdR對LNCaP人前列腺癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用

2.2 5-Aza-CdR對LNCaP人前列腺癌裸鼠血漿PSA水平的影響

5-Aza-CdR作用24天后，LNCaP荷瘤裸鼠血清FPSA濃度為(40.25±13.3)ng/mL，對照組FPSA濃度為(79.7±13.2)ng/mL，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖2。

2.3 5-Aza-CdR對LNCaP裸鼠移植瘤中AR基因表達的影響

應用real time PCR，檢測腫瘤組織中AR在mRNA水平上的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR組AR表達水平顯著降低，是對照組的0.5倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。應用Western Blot法，檢測了AR在蛋白質(zhì)水平上的變化，同樣發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR組AR表達水平顯著降低，定量比較灰度值，5-Aza-CdR組是對照組的0.4倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖3。

3 討論

前列腺癌是西方國家男性泌尿生殖系常見的惡性腫瘤。2010年美國前列腺癌居男性癌癥發(fā)病率第1位，是男性癌癥死亡的第2位。我國前列腺癌發(fā)病率雖低于歐美國家，但近年隨著人口老齡化、生活習慣的改變以及體格檢查的逐漸普及，前列腺癌的發(fā)病率也呈上升趨勢，已位居男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位。前列腺癌具有雄激素依賴性，抗雄激素治療至少對80%的晚期前列腺癌有效，但絕大多數(shù)患者會在短期內(nèi)發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌，缺乏有效的治療方法。

大量研究證實，在前列腺癌的多步驟、多階段的發(fā)生及發(fā)展過程中存在DNA甲基化水平和模式的紊亂[3，4]。一般來說，腫瘤細胞基因組整體DNA甲基化水平降低，但在某些基因的啟動子區(qū)存在甲基化水平增高現(xiàn)象，后者可導致某些抑癌基因的表達沉默，進而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 5-Aza-dC是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，能夠特異抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的活性，從而降低DNA甲基化水平。2006 年，5-Aza-CdR 已被美國食品藥品管理局批準為治療骨髓功能異常和白血病的藥物進入臨床使用，通用名為地西他濱(Decitabine)[1，5，6]。Thibault等[7]和Momparler等[8]分別對一些前列腺癌和肺癌患者在臨床上試用5-Aza-dC治療時，發(fā)現(xiàn)其對部分患者腫瘤有抑制作用，且延長了部分晚期腫瘤患者的生存時間。本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR對人前列腺癌移植瘤有明顯的抑制作用。從裸鼠移植瘤的生長曲線可以看出，從腹腔注射5-Aza-CdR的第14天開始，腫瘤的增長速度相對于對照組明顯減緩，腫瘤的生長受到抑制。至5-Aza-CdR治療后的第24天觀察結(jié)束時，5-Aza-CdR治療組腫瘤重量顯著下降，抑制率約為40%。該治療組裸鼠血清PSA濃度也顯著下調(diào)，說明5-Aza-CdR在抑制前列腺癌移植瘤生長的同時，降低了血中PSA的水平。PSA是反應前列腺癌進展狀況的特異性很強的腫瘤標記物。腫瘤在形成生長過程中持續(xù)穩(wěn)定地分泌PSA，且其分泌量隨腫瘤生長而上升。本實驗中5-Aza-CdR治療組中裸鼠血清中PSA水平與移植瘤體積均下降，兩者具有正相關關系，提示PSA可以作為潛在的評價5-Aza-CdR藥物對前列腺癌治療效果的指標。

雄激素受體(androgen receptor，AR)介導的信號通路在前列腺癌的進展過程中扮演著重要的角色[9]。AR不但在雄激素依賴性前列腺癌中具有重要作用，在雄激素非依賴性前列腺癌中也具有關鍵作用。潘壽華[10]及甘道舉[11]均證實，我國前列腺癌患者發(fā)生雄激素非依賴性轉(zhuǎn)變后并沒有出現(xiàn)AR表達的降低，反而其表達明顯上升。AR表達及轉(zhuǎn)錄水平的升高，使AR對低水平的雄激素敏感性增強，導致癌細胞在極低濃度的雄激素環(huán)境下仍能無限制增殖，這可能是發(fā)生雄激素非依賴性轉(zhuǎn)變的重要機制[12]?？梢?，AR在前列腺癌的進展中發(fā)揮著重要的作用，是治療前列腺癌的重要靶標，采用或設計新型AR拮抗劑(如AR反義核酸、肽或小分子等)減弱AR表達及降低AR轉(zhuǎn)錄，已成為潛在的治療晚期雄激素非依賴性前列腺癌的有效方法[13，14]。5-Aza-CdR藥物對AR表達的影響，已有的研究結(jié)果還沒有一個明確的結(jié)論。Sasaki 等[15]在38例前列腺癌病理組織中發(fā)現(xiàn)了3例組織中AR啟動子區(qū)高甲基化，且均處于癌癥晚期，而正常前列腺組織的AR啟動子均是非甲基化狀態(tài)，由此推斷AR啟動子區(qū)甲基化可能是前列腺癌晚期的一個事件。Jarrard等[16]證實在LNCaP細胞中，AR表達水平高，AR的啟動子區(qū)呈現(xiàn)非甲基化狀態(tài)。

圖2 5-Aza-CdR對LNCaP人前列腺癌裸鼠腫瘤體積和血清PSA的影響

圖3 5-Aza-CdR對LNCaP人前列腺癌裸鼠腫瘤內(nèi)AR表達水平的影響

本研究首次報道，5-Aza-CdR能夠顯著降低前列腺癌移植瘤中AR在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平上的表達。由于AR的啟動子區(qū)DNA呈去甲基化狀態(tài)，故5-Aza-CdR不是通過影響AR啟動子區(qū)的甲基化程度來改變AR的表達水平。至于5-Aza-CdR是通過何種途徑降低AR表達水平的，AR的表達降低是5-Aza-CdR抑制LNCaP細胞增殖的原因還是結(jié)果，我們都將在今后的研究中繼續(xù)深入地探索。由于AR對判斷前列腺癌生物學行為有參考價值，故其可作為5-Aza-CdR對前列腺癌療效判斷的參考指標。

本研究證實，5-Aza-CdR對LNCaP前列腺移植瘤生長的影響具有明顯抑制作用，能夠顯著減弱AR基因的表達，提示該去甲基化藥物可能成為治療激素或非依賴性前列腺癌可行和有價值的藥物。盡管DNA甲基化酶抑制劑對臨床上腫瘤的治療取得了較大的成績，但DNA甲基化抑制劑缺乏特異性，可能在防止一些癌癥發(fā)生的同時，也會造成基因組的不穩(wěn)定并增加其他組織發(fā)生癌癥的風險。從臨床患者和相關的動物實驗以及我們的研究發(fā)現(xiàn)，單獨應用5-Aza-dC 治療前列腺癌的效果并不十分顯著，可以嘗試著聯(lián)合內(nèi)分泌或是化學療法，通過降低腫瘤細胞基因組DNA 甲基化水平及AR的活性，為其他藥物發(fā)揮更好療效提供一個有益的細胞生物學背景。

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