時 偉，孔曉瑜，江金霞，苗憲廣

（1.中國海洋大學水產學院，山東青島266003；2.中國科學院南海海洋研究所海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室熱帶海洋生物標本館，廣東廣州510301）

舌鰨亞科魚類線粒體控制區(qū)快速進化及其重復序列延伸機制初步研究＊

時 偉1，2，孔曉瑜2＊＊，江金霞2，苗憲廣2

（1.中國海洋大學水產學院，山東青島266003；2.中國科學院南海海洋研究所海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室熱帶海洋生物標本館，廣東廣州510301）

本研究測定雙線舌鰨Cynoglossus bilineatus（Lacepède，1802）、長鉤須鰨Paraplagusia bilineata（Bloch，1787）和短鉤須鰨Paraplagusia blochii（Bleeker，1851）3種舌鰨亞科魚類的線粒體（mtDNA）控制區(qū)全序列，并與舌鰨亞科其它4種及鰈形目其他科的5種魚類mtDNA控制區(qū)結構和序列進行了比較分析。結果顯示，3種舌鰨魚類的線粒體控制區(qū)全長從655～1 155bp，長度差異明顯；舌鰨亞科魚類控制區(qū)結構與其他鰈形目魚類相似性很低，保守區(qū)系列中只能識別出CSB－A和TAS。堿基組成比較發(fā)現(xiàn)這3種舌鰨魚類的AT含量比鰈形目其它魚類要高。分析認為上述事件可能都是由該類群魚類控制區(qū)的快速進化導致的。所有3種舌鰨的控制區(qū)在5’端都存在串聯(lián)重復序列，每個重復單元中都存在類似于TAS的相關序列，并且重復序列可以形成非常穩(wěn)定的二級結構。這2種特征為形成線粒體重復序列的非正常延伸機制（Illegitimate elongation model）提供了新的證據，同時，推測了這些舌鰨魚類重復序列可能的延伸過程。

鰈形目；舌鰨亞科；控制區(qū)；重復序列；非正常延伸

舌鰨亞科（Cynoglossinae）隸屬于鰈形目（Pleuronectiformes）、鰨超科（Soleoidei）、舌鰨科（Cynoglossidae）。舌鰨科魚類大多為底層海水魚類，根據Nelson［1］2006年統(tǒng)計認為世界范圍內舌鰨科共有3屬127種，其中舌鰨亞科大約有50種左右。李思忠等［2］記錄了中國海域舌鰨科共3屬約32種，其中舌鰨亞科有29種。舌鰨亞科主要分布于西太平洋及印度洋熱帶及溫帶泥沙底海區(qū)，在溫帶隨著緯度升高種類減少；只少數(shù)能進入淡水，極少終生生活在淡水中。在我國，舌鰨亞科廣泛分布于南海、東海和黃海水域。

脊椎動物線粒體基因組大小約為15～20kb的雙鏈環(huán)狀DNA分子，通常含有13種蛋白質編碼基因、2種rRNA和22種tRNA，共計37個基因［3］。線粒體DNA（mt DNA）不同區(qū)域進化速率相差很大，一般來說，線粒體基因組中的控制區(qū)（CR）進化速率最快［4］，由于其不編碼蛋白質等原因，從而受到較小的選擇壓力，能迅速積累了較多的突變，如堿基替換、插入、缺失以及眾多的串聯(lián)重復序列等。盡管控制區(qū)進化速度快，但是其中一般都存在3個保守區(qū)域：終止相關序列區(qū)（Extended termination associated sequence domain，ETAS）、中央保守區(qū)（Central conserved sequence blocks domain，CSB A－F）和保守序列區(qū)（Conserved sequence blocks domain，CSB 1－3）［5－6］?？刂茀^(qū)的兩端經常會出現(xiàn)串聯(lián)重復序列［7－8］，關于重復序列產生機制存在多種假說，如分子內分子間重組（intra－or intermolecular recombination）［9－11］、滑鏈錯配（slippedstrand mispairing）［12］、非正常延伸（illegitimate elongation model）［13］等。

在測定的半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）的線粒體全序列中發(fā)現(xiàn)其線粒體基因組存在基因重排和易位現(xiàn)象［14］，控制區(qū)也從正常的tRNAPro和tRNAPhe之間移位到ND1基因和tRNAGln之間，并且序列發(fā)生非常顯著地變異，其序列和同1個亞目的鰨科魚類塞內加爾鰨（Solea senegalensis）［15］控制區(qū)相似性極低，和其它硬骨魚類則基本沒有相似性。在親緣關系十分相近的2個科內，存在如此巨大的差異是十分罕見的，在硬骨魚類中還沒有報道過。

為了探討線粒體控制區(qū)的重排是否穩(wěn)定存在于舌鰨亞科，本文測定了舌鰨亞科的雙線舌鰨Cynoglossus bilineatus（Lacepède，1802）、長鉤須鰨Paraplagusia bilineata（Bloch，1787）和短鉤須鰨Paraplagusia blochii（Bleeker，1851）線粒體控制區(qū)全序列，以期找到這種快速變異的原因。同時研究了舌鰨亞科魚類控制區(qū)的串聯(lián)重復序列可能的產生及延伸過程，并且對重復序列折疊的二級結構功能進行了推測。

1 材料方法

1.1 材料

本實驗用雙線舌鰨、長鉤須鰨取自湛江，短鉤須鰨樣品取自陽江，每種魚取1個樣品，取肌肉組織－20℃保存。采用OMEGA肌肉組織提取試劑盒提取的總DNA，通過1%的瓊脂糖電泳對提取的效果進行檢測。并從GenBank下載已有的鰈形目其它魚類控制區(qū)全序列（見表1）。

表1 用于本研究的鰈形目魚類線粒體控制區(qū)的相關信息Table 1 The information of mitochondrial control regions of flatfishes in this study

1.2 方法

用PCR擴增和直接測序法測定線粒體控制區(qū)全序列。根據NCBI核酸數(shù)據庫上已有的舌鰨類線粒體控制區(qū)序列設計2對引物進行PCR擴增，Z－2733：ATCCAGGTCAGTTTCTATC、F－5196：CTAAATGGTTGGGGTATGG、Pleur－Z2625：GTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACAT、Pleur－F6746：GCGGTGGATTGTAGACCCATARACAGAGGT，PCR反應總體積為25μL：2.0mmol／L MgCl2、0.2mmol／L dNTP、0.5μmol／L引物、1U／25μL LA Taq酶（Takara）、2.5μL10×LATaq酶緩沖液，以及30ng基因組DNA，滅菌雙蒸水補足體系。反應程序：95℃下5min，94℃下45s，依不同引物48～55℃退火1min，72℃延伸130s，72℃下5min，運行35個循環(huán)。PCR產物由1%的瓊脂糖電泳檢測，用寶生物純化試劑盒回收PCR產物，純化樣品送至英俊測序公司進行測序。

1.3 序列分析

測序結果用軟件CodonCode Aligner 2.0.1和Bioedit 7.0.1［16］進行拼接并輔以手工校對，獲得完整線粒體控制區(qū)全序列。利用軟件ClustalX1.8.3［17］進行序列比對排序，并輔以手工校對。使用MEGA 4.0［18］計算遺傳距離和堿基組成，DAMBE4.5［19］程序計算出轉換、顛換數(shù)與F84遺傳距離，并做成散點圖，來檢驗鰨類控制區(qū)比對數(shù)據核苷酸替代是否飽和。利用DNASIS v2.09搜索序列的發(fā)卡結構，并利用RNAFOLD［20］軟件包，在最小自由能的原則下繪制出二級結構圖。重復序列利用Tandem Repeats Finder［21］在默認參數(shù)下從控制區(qū)全序列中篩選。

2 結果

2.1 3種舌鰨亞科魚類mtDNA控制區(qū)的基本特征

結果顯示雙線舌鰨、長鉤須鰨和短鉤須鰨的線粒體控制區(qū)全序列長度具有明顯的差異，分別為655、1155和886bp，3種舌鰨魚類的線粒體控制區(qū)與半滑舌鰨一樣存在位移現(xiàn)象，由tRNAPro和tRNAPhe基因之間移位到了ND1基因下游；并且在5′末端都存在一段長度不等的重復序列。去掉重復序列獲得其片段長度分別為620、741和704bp，差異依然明顯。利用MEGA4.0計算CR序列的堿基含量，舌鰨亞科魚類A、T、C、G含量分別為31.6%～35.9%、29.7%～34.7%、18.1%～22.0%、11.1%～15.6%，AT含量比較高（62.8%～68.6%），平均AT含量為66.3%，鰈形目其他四科代表魚類的AT含量為（57.7%～63.3%），平均為60.4%（見表2）。

表2 11種鰈形目魚類控制區(qū)長度和堿基組成信息Table 2 The information of the length and base composition of CRs from 11flatfish species

圖1 7種舌鰨和2種鰨的控制區(qū)序列比對圖。Fig.1 The sequences alignment of CRs from seven tonguefishes and two soles

圖2 7種舌鰨線粒體控制區(qū)比對序列的轉換、顛換數(shù)與F84遺傳距離的比對散點圖Fig.2 Number of transition and transversion substitution versus F84distance in pairwise comparison for aligned CRs sequences of seven tonguefishes

將這3種舌鰨與GenBank中已有的舌鰨亞科的其他魚類控制區(qū)序列比較發(fā)現(xiàn)，只有196bp長度的序列有相似度，其它位置則無法比對整齊；與鰨科的帶紋條鰨和塞內加爾鰨比較則僅有22bp的序列有相似性（見圖1）。轉換、顛換的絕對數(shù)與遺傳距離比較的散點圖顯示舌鰨線粒體控制區(qū)比對序列并沒有達到飽和（見圖2），所以其數(shù)據可以用來計算遺傳距離及構建系統(tǒng)發(fā)育樹。本研究中其它鰈形目魚類則由于種類太少無法進行飽和性分析，但是隨后計算其之間的遺傳距離要小于舌鰨類，所以也可以證明其數(shù)據并未飽和，可以用來進行遺傳距離分析。利用MEGA 4.0計算Kimura雙參數(shù)遺傳距離如表3，須鰨屬內的遺傳距離的范圍從0.32～0.41，平均為0.35；舌鰨屬內從0.11～0.28，平均為0.23；舌鰨屬和須鰨屬間從0.24～0.55，平均為0.40；舌鰨亞科內從0.11～0.55，平均為為0.34。舌鰨亞科魚類控制區(qū)序列和其它鰈形目魚類無法比對整齊，故無法計算遺傳距離。鰨科的塞內加爾鰨、菱鲆科的大菱鲆、牙鲆科的牙鲆和鰈科的星突江鰈間的遺傳距離從0.08～0.43，平均為0.26（見表3）。

表3 Kimura雙參數(shù)遺傳距離（對角線以上）和成比例的遺傳距離（對角線以下）Table 3 Kimura 2－parameter genetic distances（above diagonal）and P－distances（below diagonal）

2.2 控制區(qū)序列的功能保守區(qū)域和重復序列特征

舌鰨亞科魚類和其它鰈形目魚類控制區(qū)的相似性極低，只有如圖1所示的22bp左右的堿基對有相似性（圖中標示為：鰨亞目保守序列區(qū)），這22bp保守序列塊的序列通式為TCCAG－G－G－AAGGGG和赫崇波等［22］所提出的鰈形目CSB－A的序列通式AGCGAAGGGGTTCTCTTT的前半部分相似性高，而CSBB到CSB－F，及CSB 1－3等的保守模塊則沒有被識別。而其他4科鰈形目魚類以4個代表種（塞內加爾鰨、大菱鲆、牙鲆和星突江鰈）進行比對后，有540bp左右長度的相似序列，赫崇波等所提出CSB A－F及CSB 1－3都能夠從中被識別。

3種舌鰨科魚類在5'末端都存在重復序列，拷貝次數(shù)和重復區(qū)長度都差異巨大，最長的重復區(qū)為長鉤須鰨414bp，最短的雙線舌鰨只有35bp（見表4）。3種舌鰨重復單元相似性較高，都含有保守序列塊TACAT—ATGTA。通過DNASIS v2.09搜索發(fā)卡結構發(fā)現(xiàn)，3種舌鰨的重復區(qū)都可以形成穩(wěn)定的發(fā)卡結構，短鉤須鰨形成的發(fā)卡結構的莖區(qū)長14bp，最小自由能為－13.7kcal／mol，長鉤須鰨形成的發(fā)卡結構最小自由能為－10.1kcal／mol（見圖3），雙線舌鰨雖然可以形成穩(wěn)定的發(fā)卡結構，但是卻沒有發(fā)現(xiàn)如同長鉤須鰨和短鉤須鰨一樣的長莖結構。

表4 3種舌鰨重復序列相關信息Table 4 The information of tandem repeats of CRs form three tonguefishes

圖3 2種舌鰨重復序列形成的二級結構Fig.3 Secondary structures formed by repeated sequences in two tonguefishes

3 討論

3.1 舌鰨類控制區(qū)的高速變異

3種舌鰨的線粒體控制區(qū)長度變化顯著，長度655～1155bp，去掉重復區(qū)，依然存在較大的異質性。舌鰨亞科魚類線粒體控制區(qū)相對于其它科的鰈形目魚類變異極其顯著，和鰈形目其它科的魚類的控制區(qū)基本沒有相似性（如圖1所示只有二十幾個堿基的保守序列），據此可以證明舌鰨亞科魚類控制區(qū)的特殊性。

由于序列無法比對，所以不能進行舌鰨亞科魚類和鰈形目其它魚類的系統(tǒng)發(fā)育分析，因此本文只能通過比較舌鰨亞科魚類及鰈形目其它科魚類控制區(qū)序列相關的遺傳距離來討論舌鰨亞科魚類控制區(qū)的異常變異。通過計算得到的舌鰨亞科內的Kimura雙參數(shù)遺傳距離范圍從0.11～0.55，平均為為0.34。遠大于以鰨科的塞內加爾鰨、菱鲆科的大菱鲆、牙鲆科的牙鲆和鰈科的星突江鰈為代表計算的科間的遺傳距離（0.08～0.43，平均為0.26）。即便是須鰨屬內（0.32～0.41，平均為0.35）的遺傳距離也高于上述的非舌鰨類的種間遺傳距離，雖然遺傳距離并不能完全反映出物種的系統(tǒng)關系，但存在一定的參考價值，據此可以看出，舌鰨類的控制區(qū)變異十分異常，其變異速度遠大于其它鰈形目魚類，并且這種現(xiàn)象普遍存在于舌鰨亞科。

從堿基含量上來看，舌鰨亞科魚類的AT含量也普遍高于非舌鰨鰈形目魚類（見表2），舌鰨亞科魚類AT含量從62.8%到68.6%，平均為66.3%，而其它4種鰈形目魚類AT的平均含量僅60.4%。根據DNA堿基配對原則，A與T配對形成2個氫鍵，G與C相配形成3個氫鍵，所以GC之間的連接較為穩(wěn)定。A＋T的含量可以反映出序列的變異性，具有高比例的A＋T可能是控制區(qū)序列變異較快的原因之一［23］。所以，從堿基組成中也能看出，舌鰨亞科魚類控制區(qū)序列變異性較高。

將舌鰨亞科魚類和鰈形目其它魚類比較也僅僅發(fā)現(xiàn)類似CSB－A和TAS保守序列，CSB1－3和CSB B－F等區(qū)域都無法利用鰈形目的通式找到，而其他4種鰈形目魚類（塞內加爾鰨、大菱鲆、牙鲆和星突江鰈）控制區(qū)序列則可以識別出所有這些保守序列，相互之間的相似度也高。這種存在于舌鰨亞科控制區(qū)的高速變異在硬骨魚中尚未被報道。并且，硬骨魚類1個亞科內如此多的種發(fā)生快速的變異也未見報道。

作者推測舌鰨亞科線粒體控制區(qū)這種快速的變異的原因有2種可能，1種是現(xiàn)存在舌鰨類的控制區(qū)是由原始的鰈類正常的控制區(qū)移位而來，伴隨這種移位發(fā)生控制區(qū)的某些功能喪失，從而導致控制區(qū)穩(wěn)定性減弱，穩(wěn)定性減弱便是變異快速積累的直接原因。另1種是原來的控制區(qū)丟失，線粒體其他位置又進化成為新的控制區(qū)。目前還無法明確這2種可能哪一種是發(fā)生在舌鰨類控制區(qū)的真實事件，只有測定出更多的中間過程的控制區(qū)序列才有可能被揭示。

3.2 重復序列的特征及延伸過程的推測

3種舌鰨重復區(qū)單元都含有保守序列塊TACAT—ATGTA（見表4）。這種保守塊是由2段5 bp的反向互補序列組成，也就是說可以形成發(fā)卡結構，通過DNASIS v2.09搜索發(fā)卡結構發(fā)現(xiàn)其中3種舌鰨的重復區(qū)都可以形成非常穩(wěn)定的長發(fā)卡結構。

Guo等［24］在鯉科魚類識別了TAS保守序列為：TACATAT－ATGTATTATCACCATTATATTA

ACCA，并指出TAS－cTAS組件序列為TACAT－ATGTA。Kong等［6］和張艷春等［25］在研究鰈形目相關魚類時同樣識別了這一組件，舌鰨亞科重復序列的保守序列塊和Guo等提出的TAS－cTAS組件序列完全相同，因此可以在重復序列中識別TAS序列。由于重復單元序列和Buroker等［13］描述的美洲鱘的重復單元類似，都存在TAS相關序列，并且同樣位于控制區(qū)的5'末端，所以本文的重復區(qū)為Buroker的非正常延伸模型提供了新的證據。Buroker等［13］認為線粒體復制進行到重復區(qū)時，由于每個重復單元都存在TAS相關序列，所以線粒體的復制可以被終止在任何1個TAS上，之后被置換的重鏈和新生的線粒體重鏈競爭結合模板鏈，導致新生鏈和模板鏈融解，由于新生鏈可以折疊成穩(wěn)定的二級結構，導致線粒體繼續(xù)復制時新生鏈和模板鏈的結合容易發(fā)生錯配，最終引起重復序列重復單元的增加或者減少。

作者利用非正常延伸模型結合舌鰨亞科重復區(qū)的數(shù)據模擬了舌鰨類重復單元延伸的過程。如圖4所示。當線粒體復制進行到重復區(qū)的時候，由于多個重復單元都存在終止序列，所以線粒體的復制可以被終止在任何1個重復單元上（見圖4A），當線粒體復制被終止后，由于被置換鏈的H鏈會和新生鏈競爭模板鏈會導致新生鏈的解鏈（見圖4B），新生鏈單鏈暴露后，由于反向互補序列的存在便能形成穩(wěn)定的二級結構（見圖3），這種二級結構大大增加了新生鏈3'末端與模板鏈錯配的幾率（見圖4C）。當線粒體的復制重現(xiàn)開始后就會導致重復單元增加（見圖4D）。

盡管這些重復區(qū)形成的二級結構可以作為非正常延伸模型的一個證據，但是很多重復序列并不能形成這種二級結構，也不存在TAS相關序列，所以非正常延長模型并不是重復序列延伸的唯一的模型［26］，要最終揭示重復區(qū)生成的真實過程，需要有更多的數(shù)據和進一步的研究。

圖4 根據非正常延伸模型推測的舌鰨重復區(qū)的延伸過程Fig.4 The speculated process of the elongation of repeated region in tonguefishes based on the illegitimate elongation model

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Preliminary Study on the Rapid Evolution of MtDNA Control Region and the Elongated Mechanism of Tandem Repeat Units in Cynoglossinae Fishes

SHI Wei1，2，KONG Xiao－Yu2，JIANG Jin－Xia2，MIAO Xian－Guang2
（1.College of Fisheries，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Marine Biodiversity Collection of South China Sea，South China Sea Oceanology Institute of Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301，China）

The complete control regions of mitochondrial DNA were amplified in three tongue soles Cynoglossus bilineatus（Lacepède，1802），Paraplagusia bilineata（Bloch，1787），and Paraplagusia blochii（Bleeker，1851）from subfamily Cynoglossinae，and compared with that from other four flatfishes.The length of control regions（CR）ranged from 655to 1155bp and exhibited apparent length heteroplasmy.Comparisons showed that the control regions have significant differences from that of other flatfishes，with only conserved blocks of CSB－A and TAS identified and higher AT content detected.It was presumed that these variations may have resulted in the fast evolution of CR regions in these tongue soles.Furthermore，the presence of tandem repeats at 5＇end of control regions was detected，and these repeat units bear TAS－like sequences，which the possess capability of forming the stable secondary structure in all three tongue soles.These characteristics of control regions in those soles provide likely new evidences for the illegitimate elongation model，the elongated mechanism of tandem repeat units.Additionally，the elongation process of these tandem repeats in tongue soles was speculated using illegitimate elongation model.

Pleuronectiformes；Cynoglossinae；control regions；tandem repeat；illegitimate elongation

Q349；Q959.486

A

1672－5174（2012）1－2－081－07

國家自然科學基金項目（30870283；31071890）資助

2011－04－29；

2011－05－04

時 偉（1984－），男，博士。E－mail：kcool＠126.com

＊＊通訊作者：E－mail：xykong＠scsio.ac.cn

責任編輯 王 莉