高 偉 張會(huì)鮮 孫建云 焦 波 (山東大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，山東 濟(jì)南 250012)

腦缺血一定時(shí)間恢復(fù)血液供應(yīng)后，其功能不僅不能恢復(fù)，卻出現(xiàn)更加嚴(yán)重的腦功能障礙，造成腦缺血再灌注損傷(CIR)〔1〕。珍龍醒腦膠囊是治療腦血管疾病的經(jīng)典藏藥驗(yàn)方，主要由珍珠、天竺黃、西紅花、丁香、人工牛黃、麝香、余甘子等中藥組成，臨床上用于治療缺血性腦血管疾病〔2〕，但其機(jī)制尚未有報(bào)道。本研究觀察珍龍醒腦膠囊對(duì)腦缺氧、腦缺血再灌注后丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力的影響，探討該藥抗CIR的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 珍龍醒腦膠囊，青海金訶藏藥藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20090413。腦心通膠囊，陜西步長制藥有限公司，批號(hào)110336。均以1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)制成混懸液。SOD、MDA及ATP酶試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器 紫外分光光度計(jì)，TU-1810，北京普析通用公司。

1.1.3 動(dòng)物 昆明種小鼠，18～22 g，雄性Wistar大鼠，250～300 g，雄性;均由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(魯)20090001。

1.2 方法

1.2.1 珍龍醒腦膠囊對(duì)小鼠常壓缺氧的影響 將小鼠隨機(jī)分為空白組(1%CMC-Na)、腦心通組(900 mg/kg)、珍龍醒腦組(100、200、400 mg/kg)。每天給藥1次，給藥前禁食12 h不禁水，連續(xù)7 d。于末次給藥后2 h，將小鼠置于含5 g有鈉石灰的密封250 ml廣口瓶中，以呼吸停止為指標(biāo)，觀察小鼠死亡時(shí)間。1.2.2 珍龍醒腦膠囊對(duì)小鼠斷頭缺血缺氧的影響 小鼠分組及給藥同1.2.1，于末次給藥后2 h，將小鼠斷頭，以張口為指標(biāo)，觀察斷頭后喘息時(shí)間。

1.2.3 珍龍醒腦膠囊對(duì)結(jié)扎頸總動(dòng)脈致小鼠腦缺血缺氧的影響 將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(1%CMC-Na)、模型組(1%CMC-Na)，腦心通組(900 mg/kg)、珍龍醒腦組(100、200、400 mg/kg)。每天給藥1次，給藥前禁食12 h不禁水，連續(xù)7 d。末次給藥后2 h，將小鼠麻醉后，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，夾閉10 min，再灌注10 min，反復(fù)2次。再灌注后縫合皮膚(假手術(shù)組分離出頸總動(dòng)脈，不夾閉血管，然后縫合)。24 h斷頭取腦，在低溫下分取左、右腦。取左腦稱重后置80℃烘烤2 h，稱干重，計(jì)算腦組織含水量。腦組織含水量(%)=(左腦濕重－左腦干重)/左腦濕重×100%。將右腦組織充分勻漿，采用考馬斯亮藍(lán)蛋白定量法測定蛋白含量，按照試劑盒要求測定SOD、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力和MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 珍龍醒腦膠囊對(duì)小鼠常壓缺氧的影響 動(dòng)物置密封廣口瓶中后，呼吸逐漸減弱，直至消失。用藥后各組與空白對(duì)照組〔(42.1±8.5)min〕比較，動(dòng)物存活時(shí)間有所延長，珍龍醒腦低、中劑量組小鼠存活時(shí)間為〔(45.3±9.1)、(49.9±10.6)min〕，其中腦心通〔(56.7±10.5)min〕、珍龍醒腦高劑量組〔(53.0±11.0)min〕，能明顯延長小鼠存活時(shí)間(P＜0.05)。

2.2 珍龍醒腦膠囊對(duì)小鼠斷頭缺血缺氧的影響 動(dòng)物被斷頭后，張口呼吸動(dòng)作仍會(huì)持續(xù)。用藥后，可以明顯延長斷頭后呼吸維持時(shí)間。珍龍醒腦高劑量〔(22.1±3.3)s〕和中劑量組〔(22.3±3.3)s〕以及腦心通組〔(23.2 ±3.6)s〕與空白組〔(19.1±2.7)s〕相比，均能明顯延長小鼠斷頭喘息時(shí)間(P＜0.05);珍龍醒腦低劑量組斷頭喘息時(shí)間〔(20.3±3.5)s〕雖略延長，但無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 珍龍醒腦膠囊對(duì)結(jié)扎頸總動(dòng)脈致小鼠腦缺血缺氧的影響

缺血24 h后，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦含水量明顯增加，珍龍醒腦有明顯的降低腦含水量的作用(P＜0.05或P＜0.01)。同時(shí)，模型組小鼠腦組織中MDA含量明顯升高，SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力顯著降低(P＜0.01)，珍龍醒腦可明顯降低 MDA含量，并升高 SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活力。見表1，表2。

表1 珍龍醒腦膠囊對(duì)缺血再灌注小鼠腦組織含水量、MDA和SOD的影響(x ± s，n=9)

表2 珍龍醒腦膠囊對(duì)缺血再灌注小鼠腦組織酶活力的影響(x ±s，n=9，μmol·mg－1·h－1)

3討論

腦缺血時(shí)，組織氧和能量代謝的物質(zhì)供應(yīng)不足，ATP生成減少，能量功能障礙，Na+，K+-ATP酶活性降低，使大量 Na+內(nèi)流、K+外流，使Cl－和水被動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起神經(jīng)細(xì)胞急性滲透性腫脹死亡。Na+和K+濃度改變，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，進(jìn)而電壓依賴性 Ca2+通道開放，Ca2+大量內(nèi)流。Ca2+可抑制ATP合成，使能量生成障礙〔1〕，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+異常增多，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損〔3〕，進(jìn)一步加重腦損傷。同時(shí)由于K+、蛋白激酶C及遞質(zhì)釋放等作用，受體依賴性 Ca2+通道開放，Ca2+大量內(nèi)流，造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)而導(dǎo)致氧自由基產(chǎn)生增加、花生四烯酸代謝增強(qiáng)、興奮性氨基酸遞質(zhì)(EAA)釋放增加等，導(dǎo)致神經(jīng)元壞死。ATP酶活性下降還可激活Na+泵依賴性EEA載體，使EAA大量釋放，開放Ca2+通道，加重腦損傷〔4，5〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，珍龍醒腦膠囊可明顯提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活力，有效降低腦含水量。提示珍龍醒腦膠囊可以對(duì)抗腦缺氧的能量代謝障礙，并能夠降低腦水腫的腦含水量。

腦缺血可以造成氧自由基增加〔6〕。氧化應(yīng)激損傷是腦缺血再灌注的重要環(huán)節(jié)之一，氧自由基在CIR中有重要作用。氧自由基可作用于多價(jià)不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物質(zhì)交聯(lián)，蛋白質(zhì)變性、多核苷酸鏈斷裂、堿基重新修飾，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性破壞、膜的通透性、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、膜屏障功能均受到嚴(yán)重影響，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自由基還能導(dǎo)致 EAA釋放增加，促使CIR發(fā)生〔1〕。SOD可清除自由基，提高SOD活性可以提高抗氧化作用及組織缺氧能力〔7，8〕。雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后導(dǎo)致增加脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，MDA生成增加，SOD活性下降〔9〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)珍龍醒腦組可明顯降低MAD的量，并且有效提高SOD的活力，提示可對(duì)抗CIR的氧自由基損傷。

珍龍醒腦膠囊為傳統(tǒng)藏藥，主要由珍珠、天竺黃、西紅花、丁香、人工牛黃、麝香、余甘子等中藥組成，具有活血化瘀、安神護(hù)腦、祛風(fēng)化痰、養(yǎng)陰活血、化痰通絡(luò)等功效，用于痰瘀阻絡(luò)所致的中風(fēng)，語言蹇澀，半身不遂，口眼歪斜。現(xiàn)代藥理研究表明，珍珠富含多種氨基酸，還含有微量元素、小分子活性肽、卟啉及金屬卟啉等，可以減輕自由基損傷;西紅花的化學(xué)成分主要是胡蘿卜素及其多糖苷類，可以增強(qiáng)記憶、降血壓、抗血栓;訶子含三萜類、酚酸類、脂肪族化合物，具有強(qiáng)心、抗氧化和抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用;麝香含多種氨基酸和微量元素，麝香酮具有興奮動(dòng)物呼吸的作用，可以使動(dòng)物呼吸頻率和深度增加;人工牛黃含?；撬帷⑴Ｄ懛?、去氧膽酸、膽紅素、微量元素，拮抗血小板聚集與血栓形成。該藥可以溶解血栓，消除動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，解除血管平滑肌痙攣，擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)，增加血流速度，降低血液黏度，擴(kuò)張微小動(dòng)靜脈，降低腦血管通透性。最終減少自由基損傷、提高腦灌注、保護(hù)腦細(xì)胞、提高腦功能、改善腦梗死的預(yù)后〔2〕。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證明珍龍醒腦膠囊通過降低MDA含量，升高SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力，有效降低腦含水量，對(duì)小鼠腦缺氧及CIR具有保護(hù)作用，其抗CIR作用與保護(hù)腦組織ATP酶活性、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和減輕自由基損傷有關(guān)。

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