馬勤川，江 潔，薛 勇，薛長湖，韓玉謙

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

亞臨界流體萃取高效液相色譜法測定魚肉中丙酸睪酮殘留＊

馬勤川，江 潔，薛 勇，薛長湖，韓玉謙＊＊

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

采用亞臨界1，1，1，2－四氟乙烷（R134a）萃取技術(shù)作為樣品的前處理技術(shù)，建立亞臨界流體萃取高效液相色譜法測定魚肉中丙酸睪酮殘留量的新方法。在對添加了丙酸睪酮的羅非魚肌肉樣品亞臨界R134a萃取單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過正交實驗對萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果為：萃取壓力14 MPa，萃取溫度23℃，R134a流量1.0 L／min（標(biāo)態(tài)），靜態(tài)萃取30 min，動態(tài)萃取40 min，共溶劑甲醇添加量2 m L，收集液為甲醇。收集液經(jīng)石油醚純化后，用高效液相色譜檢測。在最優(yōu)條件下，方法回收率大于90%、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%。最后，對實際樣品進(jìn)行實際檢測，魚肉冷凍干燥樣品中丙酸睪酮的殘留量為1.37μg／g。本方法首次利用亞臨界R134a萃取作為獸藥殘留分析樣品的前處理技術(shù)，萃取壓力和萃取溫度都比較低，易于大規(guī)模推廣應(yīng)用。

亞臨界萃?。?，1，1，2－四氟乙烷；前處理技術(shù)；丙酸睪酮；殘留分析；高效液相色譜

丙酸睪酮具有強(qiáng)蛋白質(zhì)同化作用，能促進(jìn)畜禽生長，提高飼料轉(zhuǎn)化率，達(dá)到大幅度提高動物養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的目的，但其在動物性食品中的殘留可能會危及消費者的健康，具有潛在的致癌性［1－2］。所以，被大部分國家禁止用于促進(jìn)動物生長，并不得在食品中檢出［3］。

動物組織中性激素殘留分析的樣品前處理方法大多采用液－液萃取、固相萃取、超臨界CO2萃取等［4－6］。液－液萃取和固相萃取費時費力，有機(jī)溶劑用量大，對環(huán)境有污染，不利于操作人員的健康；超臨界CO2萃取雖然具有效率高、選擇性好、綠色環(huán)保等一系列顯著的優(yōu)點，但同時也存在著操作壓力高、設(shè)備造價大、不易推廣應(yīng)用等缺點。

近幾年新出現(xiàn)的亞臨界流體萃取技術(shù)，可以在比較低的壓力下實現(xiàn)比較好的萃取效果，克服了超臨界CO2萃取存在的一些缺點，因而受到了越來越多的重視。由于1，1，1，2－四氟乙烷（R134a）具有臨界條件（T c＝101.1℃，P c＝4.06 MPa）易于達(dá)到、低毒、惰性、不易燃以及不破壞臭氧層（ODP＝0）等特點，所以成為亞臨界流體的首選［7］。但是，目前國際上對亞臨界R134a萃取技術(shù)的研究仍主要集中在有關(guān)成分的萃取方面［8－10］，未見作為分析樣品前處理技術(shù)研究的公開報道。僅有Frank C.Calvosa［11］的一篇關(guān)于室內(nèi)灰塵中多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）殘留樣品前處理技術(shù)的報道，但采用的是超臨界狀態(tài)的R134a，仍歸屬于超臨界流體萃取技術(shù)。

本文首次采用亞臨界R134a萃取技術(shù)作為生物樣品殘留分析的前處理技術(shù)，通過對羅非魚肉中丙酸睪酮萃取操作條件的優(yōu)化，建立了1種亞臨界流體萃取高效液相色譜檢測魚肉中丙酸睪酮殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

亞臨界R134a萃取裝置（自制），萃取釜容積為50 mL；RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；安捷倫HPll00高效液相色譜儀（美國，Agilent公司），具紫外檢測器。Anke GL－20G－Ⅱ高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），XO－3200DTS超聲波震蕩器（南京先歐儀器廠）。

R134a（英國，KLEA公司，純度大于99.9%）；丙酸睪酮標(biāo)準(zhǔn)品（德國，Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇（色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；石油醚（煙臺三和化學(xué)試劑有限公司）；羅非魚（青島羅非魚良種場，無丙酸睪酮殘留）；魚飼料（青島羅非魚良種場）；超純水。

1.2 丙酸睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg的丙酸睪酮標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用純甲醇定容至100 m L，得100 mg／L的丙酸睪酮標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由丙酸睪酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品預(yù)處理 取鮮活羅非魚肌肉，切成0.5 cm3的小塊，勻漿后冷凍干燥，干燥的魚肉磨成粉，放入干燥器中備用。

1.3.2 亞臨界R134a萃取 亞臨界R134a萃取裝置及流程分別見圖1和2。在萃取釜底部放入玻璃棉，然后準(zhǔn)確稱取0.5 g預(yù)處理的樣品放入萃取釜中，加入200μL濃度為100 mg／L的丙酸睪酮標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，室溫下?lián)]發(fā)5 min，然后在萃取釜頂部放入玻璃棉和2 m L甲醇作為共溶劑。打開R134a儲罐閥門，液態(tài)R134a經(jīng)過濾器凈化后進(jìn)入冷凝器冷卻，經(jīng)冷卻的液態(tài)R134a經(jīng)高壓柱塞泵加壓，然后經(jīng)預(yù)熱器預(yù)熱后進(jìn)入萃取釜達(dá)到設(shè)定的壓力和溫度。萃取釜的壓力控制在設(shè)定壓力的1±5%范圍內(nèi)。萃取釜通過水浴控溫，溫度變化小于±1℃。先靜態(tài)萃取30 min，然后動態(tài)萃取一定時間，在分離釜里用10 m L甲醇收集萃取物，R134a的流量控制在1.0 L／min（標(biāo)態(tài)）。

圖1 R134a萃取裝置Fig.1 R134a extraction device

圖2 R134a萃取工藝流程圖Fig.2 Schematic diagram of the R134a extraction apparatus

1.3.3 樣品的凈化 把甲醇收集液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，加入2 mL水和8 mL的石油醚，充分震蕩1～2 min，4 000 r／min離心10 min，棄去石油醚層，加入8 m L石油醚按照上述方法再重復(fù)操作一次后，甲醇溶液在40℃水浴條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，準(zhǔn)確加入5 m L甲醇溶解殘渣。經(jīng)聚四氟乙烯膜過濾，待高效液相色譜分析。

1.4 色譜條件

安捷倫HPll00高效液相色譜儀，檢測器：紫外－二極管陣列檢測器（檢測波長254 nm）；色譜柱：Zorbax SB－C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：甲醇－水（V∶V＝80∶20），流速0.8 m L／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

1.5 實際樣品的準(zhǔn)備及檢測

稱取1 kg的魚飼料和200 g的淀粉，充分混勻。然后稱取5 mg的丙酸睪酮溶解于200 m L的乙醇水溶液（V∶V＝50∶50）后，均勻噴灑在魚飼料上，充分拌勻，避免結(jié)塊。噴拌好的飼料封閉12 h，在陰涼處涼24 h后使用。

隨機(jī)撈取羅非魚苗（約200 g）5尾置于0.8 m×0.5 m×0.4 m的水池中蓄養(yǎng)。試驗期間溫度控制在25℃左右。每天投喂2次，投喂量為魚體總重量的5%。每天換水1次，換水量為水箱總體積的1／3，保持水環(huán)境良好。連續(xù)投喂扮有丙酸睪酮的飼料30 d，然后取鮮活羅非魚肌肉，切成0.5 cm3的小塊，勻漿后冷凍干燥。把干燥后的魚肉磨成粉，稱取0.5 g魚肉冷凍干燥樣品進(jìn)行亞臨界萃取和純化，待高效液相色譜儀分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

由丙酸睪酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇配成2、4、6、8和10 mg／L系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液。將系列濃度分別進(jìn)樣20μL，在高效液相色譜儀上測定峰面積，測得丙酸睪酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝52.93x－25.386，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 2，說明丙酸睪酮檢測濃度在2～10 mg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在3倍信噪比下，檢出限為0.1 mg／L。

2.2 亞臨界R134a前處理條件的優(yōu)化

影響亞臨界R134a從魚肉中萃取丙酸睪酮回收率的主要因素包括樣品含水率、萃取模式、萃取壓力、萃取時間、萃取溫度、R134a流量、共溶劑的種類和添加量、吸收劑的種類等，可以看出影響本實驗的因素比較多，因此對提取過程的合理優(yōu)化就變得異常重要。所以，本實驗在進(jìn)行正交優(yōu)化實驗設(shè)計之前，通過預(yù)實驗對部分影響因素首先進(jìn)行了研究和確定，發(fā)現(xiàn)以冷凍干燥后的魚肉（水分含量≤3%）作為萃取樣品、共溶劑為甲醇（添加量為2 m L）、萃取模式為先靜態(tài)萃取30 min后再進(jìn)行動態(tài)萃?。≧134a流量1 L／min）、吸收劑為甲醇的實驗條件下，可以得到比較好的萃取回收率。在上述預(yù)實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，再以影響亞臨界R134a萃取效果的最主要的3個關(guān)鍵因素：萃取壓力、萃取溫度和動態(tài)萃取時間為正交實驗法的影響因素，設(shè)計了L9（33）正交實驗，因素水平見表1。正交實驗指標(biāo)以丙酸睪酮的萃取回收率為評價指標(biāo)，回收率越高，表明實驗條件越佳，結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

從表2可以看出，9個正交實驗的樣品回收率的全部結(jié)果都在70.68%～94.75%之間，全部達(dá)到了國際上對獸藥殘留檢測方法回收率在70%～120%的要求（Criteria by AOAC／FAO／IAEA／IUPAC），說明采用亞臨界R134a萃取技術(shù)作為魚肉中丙酸睪酮殘留分析樣品的前處理技術(shù)是完全可行的。此外，在最優(yōu)的實驗條件（A3B3C1）下，即壓力14 MPa，動態(tài)萃取時間40 min，溫度23℃時，樣品的回收率達(dá)到了94.75%，說明最優(yōu)的實驗條件下，本方法的準(zhǔn)確度高。根據(jù)極差大小，可以判斷各因素對丙酸睪酮回收率的影響程度。因素的主次關(guān)系為：壓力＞動態(tài)萃取時間＞溫度。隨著壓力的升高和動態(tài)萃取時間的延長，丙酸睪酮的回收率逐漸增加，這是因為亞臨界R134a的密度隨著壓力的升高而升高，而動態(tài)萃取時間的延長說明溶劑的用量在增加，溶劑密度和用量的提高都意味著溶解能力的相應(yīng)提高。但是，溫度的升高對丙酸睪酮的回收率卻是呈下降趨勢的，在低溫條件下回收率較高。這可能是因為隨著溫度的升高使得亞臨界R134a的密度降低，分子間距增大，分子碰撞的幾率減小，從而導(dǎo)致溶解物質(zhì)的能力下降所造成的［12］。

亞臨界R134a對脂溶性物質(zhì)具有比較強(qiáng)的萃取能力，所以對魚肉中脂溶性的丙酸睪酮具有比較理想的萃取效果。但與此同時，魚肉中的脂肪和其它一些脂類成分也不可避免的會被同時萃取出來，如果不加以適當(dāng)?shù)膬艋幚恚瑫罄m(xù)離線的HPLC檢測形成干擾。所以，本實驗在亞臨界R134a萃取完成后，仍需要用少量石油醚對甲醇收集液進(jìn)行了脫脂凈化，然后再進(jìn)行HPLC檢測，以完全消除脂類成分的影響和干擾。今后的研究過程中有必要重點研究利用預(yù)萃取凈化技術(shù)、固相吸附凈化和色譜聯(lián)用等技術(shù)實現(xiàn)在線脫脂，以解決后續(xù)使用有機(jī)溶劑脫脂凈化這一問題。

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

取羅非魚魚肉冷凍干燥樣品3份，各0.5 g，分別加入丙酸睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液100、150和200μL，使魚肉中丙酸睪酮的含量達(dá)到10、15、20μg。在相同的優(yōu)化實驗條件下（壓力14 MPa，溫度23℃，靜態(tài)萃取30 min，動態(tài)萃取40 min，共溶劑甲醇2 m L，流量1 L／min）進(jìn)行丙酸睪酮加標(biāo)回收實驗，每組重復(fù)3次，回收率均在90%以上，RSD小于5%（見表3）。說明本方法對魚肉中丙酸睪酮的檢測重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高。

表3 丙酸睪酮加標(biāo)回收率實驗結(jié)果Table 3 Spiked recoveries of testosterone propionate

2.4 實際樣品的測定結(jié)果

用含有丙酸睪酮的飼料投喂羅非魚，使得魚體內(nèi)累積丙酸睪酮，用此鮮活羅非魚肌肉進(jìn)行實際檢測，驗證所建方法的可行性。取羅非魚魚肉冷凍干燥樣品0.5g用于亞臨界R134a提取前處理，實驗結(jié)果為對實際樣品中丙酸睪酮的殘留量為1.37μg／g，說明亞臨界R134a萃取技術(shù)作為魚肉中丙酸睪酮殘留分析樣品的前處理技術(shù)是完全可行的。

3 結(jié)語

本實驗在最優(yōu)條件下，亞臨界R134萃取魚肉中丙酸睪酮的加標(biāo)回收率均在90%以上，RSD＜5%，并通過對實際樣品的檢測進(jìn)行了方法的驗證，證明了亞臨界R134a萃取技術(shù)作為魚肉中丙酸睪酮殘留分析樣品的前處理技術(shù)是完全可行的。本方法中亞臨界R134a萃取過程只需1h左右，有機(jī)溶劑用量僅為常規(guī)方法的1／10，與常規(guī)方法比較，本方法具有萃取和分離同步完成，操作周期短，分析效率高，環(huán)境污染少，分析結(jié)果準(zhǔn)確、可靠等特點。

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Determination of Testosterone Propionate Residues in Aquatic Products Using Subcritical 1，1，1，2－tetrafluoroethane（R134a）Extraction and Liquid Chromatography

MA Qin－Chuan，JIANG Jie，XUE Yong，XUE Chang－Hu，HAN Yu－Qian
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Using Subcritical 1，1，1，2－tetrafluoroethane（R134a）extraction as sample preparation technique，a new subcritical fluid extraction－liquid chromatography method for determination of testosterone propionate residues in aquatic products was developed.Tilapia muscle fortified with testosterone propionate was dealt with subcritical R134a extraction，and on the basis of single factor experiments，orthogonal design experiments was used to optimize the effecting factors.The optimized extracting conditions were as follows：pressure 14 MPa，temperature 23℃，static extraction time 20 min，dynamic extraction time 40 min，cosolvent 2 m L methanol，and 1.0 L／min R134a flow.Methanol was used as collecting solvent，and the residues were purified by liquid－liquid extraction with petroleumether and determined by HPLC.The average recovery of testosterone propionate was greater than 90%，and the RSD were less than 5%.Finally，the positive tissue control was measured in practice，and the residue of testosterone propionate was 1.37μg／g.It is for the first time at home and abroad that subcritical R134a extraction was used as pretreatment technology for residue analysis.And subcritical R134a extraction has low extraction pressure and temperature，so it can be applied in large－scale application.

subcritical fluid extraction；1，1，1，2－tetrafluoroethane；preparation technique；Testosterone propionate；residue analysis；HPLC

O652

A

1672－5174（2012）09－048－05

國家自然科學(xué)基金項目（31071541）；青島市科學(xué)發(fā)展計劃項目（11－2－4－1－（5）－jch）資助。

2011－06－20；

2012－05－17

馬勤川（1983－），男，碩士生。E－mail：maqinchuan87＠163.com

＊＊通訊作者：E－mail：hanyuqian＠ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 朱寶象