沈彥偉 高旭霞 李晶晶 譚純文 袁瑛

腫瘤具有免疫逃逸功能是其典型生物學(xué)特性之一，其免疫逃逸的機(jī)制一直是腫瘤免疫領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，目前主要?dú)w結(jié)于腫瘤弱抗原性和腫瘤的免疫抑制效應(yīng)所致。機(jī)體無法激起正常的免疫應(yīng)答來清除腫瘤細(xì)胞的原因，與腫瘤微環(huán)境中局部富集的免疫抑制性細(xì)胞(如Treg、MDSC、M2巨噬細(xì)胞等)，降低了有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān)。人體免疫系統(tǒng)的獲得性免疫防御機(jī)制包括體液免疫和細(xì)胞免疫，在抗腫瘤免疫中起主導(dǎo)作用的是細(xì)胞免疫。T細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的中心環(huán)節(jié)，但1995年前后有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，CD4陽性T淋巴細(xì)胞中有一群表面標(biāo)志CD25陽性的細(xì)胞即CD4+CD25+T細(xì)胞，不僅不能“輔助”免疫反應(yīng)，反而有顯著抑制作用，將其命名為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)[1-3]。近年來，國(guó)內(nèi)外都已有報(bào)道，腫瘤患者血液及瘤體組織中，Treg細(xì)胞的數(shù)量明顯高于正常人，揭示了腫瘤免疫微環(huán)境的本質(zhì)[1，4]。腫瘤患者外周血中增加的Treg細(xì)胞究竟來源何處？有文獻(xiàn)表明，Treg細(xì)胞分為兩類，其都表達(dá)CD4、CD25和FoxP3基因，一類是在胸腺T細(xì)胞成熟過程中自然發(fā)生的nTreg(natural Treg)；另一類是在T細(xì)胞成熟過程中，幼稚型T細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子(TGF-β和retinoic acid)誘導(dǎo)分化而來的iTreg(induced Treg)[5]。結(jié)合腫瘤細(xì)胞高表達(dá)并分泌TGF-β這一現(xiàn)象，有學(xué)者認(rèn)為，在腫瘤原位的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中(tumor infiltrated lymphocyte，TIL)存在大量由腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTreg細(xì)胞，從而形成免疫抑制性微環(huán)境[6]。這一發(fā)現(xiàn)給腫瘤免疫逃逸學(xué)說提供了依據(jù)。而有關(guān)腫瘤微環(huán)境中其他免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞MΦ，樹突狀細(xì)胞DC等)調(diào)控腫瘤免疫逃逸的研究也已經(jīng)大量報(bào)道[7-10]。

腫瘤的化療具有一定免疫調(diào)節(jié)功能，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，化療藥物不僅可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，而且還能通過影響免疫細(xì)胞的功能來提高機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。但需特別注意的是，某些化療藥物也可能造成Treg增殖反彈。荷瘤小鼠使用大劑量伊立替康聯(lián)合氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸時(shí)，Treg數(shù)目在淋巴細(xì)胞恢復(fù)期顯著上升。那么，Treg細(xì)胞在化療減輕瘤負(fù)荷及手術(shù)切除腫瘤的過程中，在腫瘤患者體內(nèi)是否隨著腫瘤的負(fù)荷而產(chǎn)生數(shù)目及功能的相應(yīng)變化？手術(shù)或化療之后，腫瘤微環(huán)境的改變，對(duì)機(jī)體整體的自然殺傷細(xì)胞(natural killer,NK)、CD4/CD8T細(xì)胞、Treg細(xì)胞是否產(chǎn)生了一系列的調(diào)節(jié)？本文旨在探討腫瘤患者化療前后，外周血免疫激活細(xì)胞及免疫抑制細(xì)胞比例變化。

材料與方法

一、材料

1.人源標(biāo)本：病例選自2010年2月至2012年2月在本院腫瘤科住院的晚期惡性腫瘤患者(肺癌、腸癌、乳癌、食道癌、胃癌)共140例，其中包括結(jié)直腸癌31例、胃癌21例、肺癌61例、乳腺癌27例，腫瘤患者化療前、化療1次后、2次后、3次后、4次后、5次后外周靜脈血。其中男性80例，女性50例；年齡28～81歲，中位年齡57歲。同時(shí)從門診體檢部門獲得38例健康人的血樣作為對(duì)照組的設(shè)立。年齡15～81歲，中位56歲，其中男23例，女15例，均排除糖尿病、甲亢、甲減、腫瘤等疾病。

2.流式細(xì)胞術(shù)用試劑：APC-anti-hCD4、FITC-anti-hCD8、PE-anti-hCD3、FITC-anti-hCD4、PECy5-anti-hCD127、FITC-anti-hCD3、PE-anti-hCD 56及PE-anti-hCD25(eBioscience)；PBS(pH 7.4)：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，無水Na2HPO41.44 g，無水KH2PO40.24 g，雙蒸水1 L溶解，調(diào)整pH值，高壓滅菌。取BD肝素抗凝的外周血2 ml，室溫下孵育15 min，PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀(Becton Dickson FACSCalibur,USA)檢測(cè)，Cellquest軟件分析數(shù)據(jù)，記錄陽性細(xì)胞百分率，減去非特異對(duì)照值。

二、方法

流式細(xì)胞術(shù)分析：所有健康人外周血、惡性腫瘤患者外周血樣本均為EDTA抗凝血(BD)，加紅細(xì)胞裂解液，分離得到的PBMC懸液。首先使用預(yù)冷PBS洗滌2遍，再經(jīng)4℃抗體孵育30 min染色后，離心PBS洗滌一次。使用200 μl PBS重懸細(xì)胞，F(xiàn)CM流式細(xì)胞術(shù)分析患者外周血中CD4+/CD8+T細(xì)胞比例及CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞的比例及NK細(xì)胞比例。使用的抗體列于下方：APC-anti-hCD4、FITC-anti-hCD8、PE-anti-hCD3、FITC-anti-hCD4、PECy5-anti-hCD127、FITC-anti-hCD3、PE-anti-hCD5及PE-anti-hCD25(eBioscience)流式分析所用儀器為FACSCalibur，軟件使用Cell Quest。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次以保證系統(tǒng)穩(wěn)定性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 18.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，比較腫瘤患者與健康對(duì)照組的外周血中Treg及NK細(xì)胞量。用重復(fù)測(cè)量方差分析，比較腫瘤患者化療前后外周血中Treg及NK細(xì)胞比例的變化。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的比值平均數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.腫瘤患者外周血中NK細(xì)胞及Treg比例均顯著高于健康對(duì)照組統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(圖1，表1)，采集的69例初次確診的惡性腫瘤患者外周血中NK細(xì)胞比例(18.56%±9.19%)要顯著高于健康人(12.37%±6.24%)，Treg細(xì)胞比例(6.95%±8.96%)也顯著高于健康對(duì)照組(4.25%±2.59%)。

2.腫瘤患者化療過程外周血中NK細(xì)胞及Treg比例的變化趨勢(shì)：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示(表2)，對(duì)69例腫瘤患者化療過程后續(xù)隨訪中發(fā)現(xiàn)，外周血中NK細(xì)胞比例以及Treg細(xì)胞比例雖然有些變化，而且一直高于化療前水平，但隨著化療進(jìn)程，NK細(xì)胞以及Treg的比例變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD4+T輔助細(xì)胞與CD8+T殺傷細(xì)胞的百分比和比例變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

針對(duì)患者所患腫瘤不同進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)不同的惡性腫瘤，化療期間CD4+輔助性T細(xì)胞、CD8+殺傷性T細(xì)胞、CD4+CD25highCD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及CD3-CD56+NK細(xì)胞百分比有不同的變化趨勢(shì)：在結(jié)直腸癌、胃癌患者中發(fā)現(xiàn)，CD4+輔助性T細(xì)胞、CD4+CD25highCD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在化療前呈較高水平，隨著化療的進(jìn)行，有著先降低后升高的趨勢(shì)，而CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞在化療前呈低水平。隨著化療的進(jìn)行，有著先升高后降低的趨勢(shì)，同時(shí)天然免疫殺傷細(xì)胞NK在化療過程中也出現(xiàn)了先升高后降低趨勢(shì)。

而在肺癌及乳癌患者的化療過程中，CD4+輔助性T細(xì)胞、CD4+CD25highCD127+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、天然免疫殺傷細(xì)胞NK細(xì)胞，這四種CD分型的淋巴細(xì)胞的變化趨勢(shì)恰好與胃癌、結(jié)直腸癌患者呈相反變化(圖2～5)。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01,bP<0.05

表2 腫瘤患者化療前后外周血中NK細(xì)胞及Treg比例的變化

討論

人體的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)主要取決于人體對(duì)外來抗原的免疫反應(yīng)以及對(duì)自身抗原免疫耐受之間的平衡。而腫瘤細(xì)胞本身帶有一些自身抗原，故許多研究者認(rèn)為機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)與自身免疫反應(yīng)有著共同的基礎(chǔ)。Treg細(xì)胞作為腫瘤免疫逃避機(jī)制中的一種重要媒介正受到越來越多的關(guān)注。它在多種腫瘤患者的外周血和腫瘤組織呈現(xiàn)高表達(dá)，其可能通過抑制活化的T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用。

相關(guān)研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體內(nèi)的Treg細(xì)胞會(huì)不斷增高[11]，故老年人腫瘤發(fā)病率較青年人高，這可能與Treg細(xì)胞在腫瘤免疫逃避中發(fā)揮的作用相關(guān)。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，在惡性腫瘤患者中，CD4+CD25highCD127-Treg及NK細(xì)胞比例較正常人對(duì)照組明顯增高。而人體固有免疫在抗腫瘤免疫反應(yīng)中也起著重要作用，化療前后NK細(xì)胞未見明顯變化，說明化療并未抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)。

本研究由于樣本數(shù)量有限，沒有統(tǒng)計(jì)得到化療期間患者外周血中的各型淋巴細(xì)胞的顯著差異，但是仍然發(fā)現(xiàn)到一些我們值得探討的趨勢(shì)。隨著化療的進(jìn)行，Treg和NK細(xì)胞，CD8細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞之間此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)，隨著本研究的繼續(xù)深入，可能進(jìn)一步證實(shí)Treg細(xì)胞在腫瘤中富集，形成免疫抑制微環(huán)境，是通過抑制CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的腫瘤殺傷效應(yīng)，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的可能。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，腫瘤患者Treg比例明顯增高，如果能下調(diào)Treg細(xì)胞的比例將有助于提高機(jī)體抗腫瘤能力。目前已有多種免疫抑制信號(hào)相關(guān)的阻斷抗體上市(如CTLA-4的抗體Ipilimumab等)故去除腫瘤患者的Treg細(xì)胞可能是治療腫瘤的一種有效的新療法。

(本文圖1～5見光盤)

[1]EbertEC,Roberts AI,Devereux D,et al.Selective immunosuppressive action of a factor produced by colon cancer cells[J].Cancer Res,1990,50(16):6158-6161.

[2]Sakaguchi S,Toda M,Asano M,et al .T cell-mediated maintenance of natural self-tolerance:its breakdown as a possible cause of various autoimmune diseases[J].J Autoimmun,1996,9(2):211-220.

[3]Sakaguchi S,Sakaguchi N,Shimizu J,et al.Immunologic tolerance maintained by CD25+CD4+regulatory T cells:their common role in controlling autoimmunity,tumor immunity,and transplantation tolerance [J].Immunol Rev,2001 Aug,182:18-32.

[4]劉莉,丁乾,姚軍霞,等.結(jié)直腸癌患者外周血CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分析[J].中華腫瘤防治雜志,2007,14(2):110-113.

[5]Chen W,Jin W,Hardegen N,et al.Conversion of peripheral CD4+CD25-naive T cells to CD4+CD25+regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3[J].J Exp Med,2003,198(12):1875-1886.

[6]Strauss L,Bergmann C,Gooding W,et al.The frequency and suppressor function of CD4+CD25highFoxp3+T cells in the circulation of patients with squamous cell carcinoma of the head and neck[J].Clin Cancer Res,2007,13(21):6301-6311.

[7]Ding T,Xu J,Wang F,et al.High tumor-infiltrating macrophage density predicts poor prognosis in patients with primary hepatocellular carcinoma after resection[J].Hum Pathol,2009,40 (3):381-389.

[8]Haringer B,Lozza L,Steckel B,et al.Identification and characterization of IL-10/IFN-gamma-producing effector-like T cells with regulatory function in human blood[J].J Exp Med,2009,206(5):1009-1017.

[9]Dobrzanski MJ,Rewers-Felkins KA,Quinlin IS,et al.Autologous MUC1-specific Th1 effector cell immunotherapy induces differential levels of systemic TReg cell subpopulations that result in increased ovarian cancer patient survival[J].Clin Immunol 2009,133(3):333-352.

[10]Liu Q,Zhang C,Sun A,et al.Tumor-educated CD11bhighIalow regulatory dendritic cells suppress T cell response through arginase I[J].J Immunol 2009,182(10):6207-6216.

[11]De Ferranti S,Rifai N.C-reactive protein and cardiovascular disease:a review of risk prediction and interventions[J].Clin Chim Acta,2002,317(1-2):1-15.