周海林，劉 瑞，周毅峰

(湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施，445000)

硒是人體所必需的微量元素，也是植物生長(zhǎng)的有益元素[1].目前，對(duì)植物施硒的主要方法有：土施、葉面噴肥、浸種或拌種，以此提高植物體內(nèi)硒的含量，以滿足人和動(dòng)物的生理需求.植物對(duì)土壤中硒的吸收與植物種類、土壤硒含量、土壤質(zhì)地、pH值、土壤氧化還原電位、土壤水分含量、土壤鹽度等因素有關(guān)[2].其中土壤中有機(jī)質(zhì)、鹽類等因素對(duì)硒酸根和亞硒酸根起著固定作用而轉(zhuǎn)換成非有效硒，另一方面，復(fù)雜的土壤微生物又對(duì)固定的硒起到釋放和吸收轉(zhuǎn)化作用[3].此外，其它離子如硫酸根離子的競(jìng)爭(zhēng)和一些耕作措施也會(huì)對(duì)土壤硒的有效性產(chǎn)生一定的影響[4-5].大豆是十分重要的糧食作物，在全世界分布廣泛，其吸收能力、耐受能力及貯存能力都非常強(qiáng)，因此，通過(guò)大豆對(duì)人和動(dòng)物進(jìn)行補(bǔ)硒是十分有效的途徑.前期研究發(fā)現(xiàn)，大豆對(duì)不同的基質(zhì)中硒的吸收情況不同，產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)或毒性表現(xiàn)也不同.因此，本文利用蛭石培養(yǎng)大豆，結(jié)合不同的硒濃度處理?xiàng)l件下，研究大豆的表觀性狀、生物學(xué)性狀、葉綠素和脯氨酸及可溶性蛋白等生理生化指標(biāo)的影響，研究大豆對(duì)硒的吸收及耐受機(jī)制，為大豆補(bǔ)硒提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料

供試大豆購(gòu)于恩施種子站.選取籽粒飽滿的大豆用25℃的溫水浸泡大豆，挑選發(fā)芽狀況好的大豆，移栽于50 g滅菌蛭石中，加入含不同硒濃度的Hogland培養(yǎng)液100 mL，過(guò)5 d加入50 mL蒸餾水.28℃、1 500Lux培養(yǎng)，定期觀察并測(cè)定其相關(guān)數(shù)據(jù).

1.2 設(shè)備與藥品

1.2.1 藥品 考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白為生化試劑；蔗糖、酸性茚三酮、乙醇、甲苯、苯酚、冰乙酸、三氯乙酸，巴比妥酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、濃硫酸、磺基水楊酸為分析純?cè)噭?

1.2.2 主要設(shè)備 分光光度計(jì)(WFJ2100，上海尤尼柯儀器有限公司);Tu-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Tu-1810，北京普析儀器有限公司生產(chǎn));離心機(jī)(Anke LXJ-ⅡB，上海艾測(cè)電子科技有限公司);恒溫水浴鍋(HH-4，上海-恒科技有限公司);電子天平(JA2003N，上海精密科學(xué)儀器有限公司).

1.3 測(cè)定方法

可溶性蛋白含量分析：參考文獻(xiàn)[6]提取可溶性蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量；可溶性糖含量分析：參考文獻(xiàn)[7]提取大豆葉片可溶性多糖，采用苯酚-硫酸法測(cè)定大豆可溶性多糖含量；脯氨酸含量分析：參考文獻(xiàn)[8]提取大豆葉片中脯氨酸，采用茚三酮比色法測(cè)定脯氨酸含量；丙二醛含量的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[8]提取大豆葉片中丙二醛，采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定丙二醛含量；葉綠素含量分析：參考文獻(xiàn)[6]提取并測(cè)定葉綠素含量.

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硒濃度處理對(duì)大豆表觀性狀的影響

將發(fā)芽的大豆移栽于蛭石中，并施以不同濃度的硒處理，硒濃度分別為0、0.5、1、5、10、20、40 μg·mL-1，移栽10 d后拍照，結(jié)果見(jiàn)圖1.不同硒濃度處理已顯示出明顯的差異，當(dāng)蛭石中硒濃度大于5.0 μg·mL-1時(shí)，大豆苗的生長(zhǎng)明顯受到抑制，而小于5.0 μg· mL-1時(shí)，大豆苗的生長(zhǎng)情況變化不明顯.因此，將硒濃度減小為0、0.1、0.5、1、5、10 μg·mL-1，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，移栽18 d后拍照，結(jié)果見(jiàn)圖2. 隨著硒濃度的增加，大豆總體生長(zhǎng)量下降，但在0.1 μg·mL-1組大于對(duì)照組，10 μg·mL-1組受到抑制，硒中毒癥狀也比較明顯，據(jù)觀察高濃度硒處理時(shí)，大豆中毒現(xiàn)象為：葉片出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，根變紅，原因可能是大豆將硒還原為硒單質(zhì).說(shuō)明一定濃度的硒可促進(jìn)大豆生長(zhǎng)，過(guò)高濃度則抑制其生長(zhǎng).

圖1 不同硒濃度處理對(duì)大豆表觀性狀的影響 圖2 不同硒濃度處理對(duì)大豆表觀性狀的影響

2.2 不同硒濃度處理對(duì)大豆生物性狀的影響

2.2.1 不同硒濃度處理對(duì)大豆凈增重的影響 將發(fā)芽10 d大豆幼苗轉(zhuǎn)栽于蛭石中，經(jīng)過(guò)18 d測(cè)定其凈增重，結(jié)果見(jiàn)圖3.當(dāng)蛭石中加入硒溶液的硒濃度在0～1 μg·mL-1時(shí)，大豆苗凈增生物量隨著硒濃度的增加而增加，但無(wú)顯著差異.當(dāng)硒濃度大于為1 μg·mL-1時(shí)，大豆苗凈增生物量隨著硒濃度升高而降低，并呈極顯著的負(fù)相關(guān)(r=1-0.983︱>0.75，y=-7.679 4x+17.142 6，y表示蛭石中加入硒溶液硒的濃度，x表示大豆苗凈增生物量)且各處理之間的凈增生物量具有極顯著差異.因此，從凈增重這個(gè)生物量來(lái)考察，在采用蛭石作為培養(yǎng)基質(zhì)時(shí)，加入硒溶液中適宜的硒濃度應(yīng)在1 μg·mL-1以下.

2.2.2 不同硒濃度處理對(duì)大豆凈增株高的影響 在測(cè)定大豆凈增重后，對(duì)其凈增株高進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4.當(dāng)蛭石中加入硒溶液的硒濃度在0～0.5 μg·mL-1時(shí)，大豆苗凈增生物量隨著硒濃度的增加而增加，但無(wú)顯著差異.當(dāng)硒濃度大于為0.5 μg·mL-1時(shí)，大豆苗凈增生物量隨著硒濃度升高而降低，并呈極顯著的負(fù)相關(guān)(r=|-0.917 6|>0.75，y=-2.513 7x+32.173 5，y表示蛭石中加入硒溶液硒的濃度，x表示大豆苗凈增生物量)且具有極顯著差異.因此，從凈增株高這個(gè)生物量來(lái)考察，在采用蛭石作為培養(yǎng)基質(zhì)時(shí)，加入硒溶液中適宜的硒濃度應(yīng)在0～0.5 μg·mL-1.

圖3 不同硒濃度處理對(duì)大豆凈增重的影響 圖4 不同硒濃度對(duì)大豆凈增株高的影響

2.2.3 不同硒濃度處理對(duì)大豆葉片生物量的影響 為了解不同硒濃度處理大豆葉片的變化情況，測(cè)定了葉片的生物量，結(jié)果見(jiàn)圖5.當(dāng)蛭石中加入硒溶液的硒濃度在0～1 μg·mL-1時(shí)，大豆苗葉片生物量隨著硒濃度的增加而增加，但無(wú)顯著差異.當(dāng)硒濃度大于為1 μg·mL-1時(shí)，大豆苗凈增生物量隨著硒濃度升高而降低，并呈極顯著的負(fù)相關(guān)(r=|-0.981 04|>0.75，y=-19.07x+27.490 59，y表示蛭石中加入硒溶液硒的濃度，x表示大豆苗葉片生物量)且具有極顯著差異.因此，從葉片生物量這個(gè)生物量來(lái)考察，在采用蛭石作為培養(yǎng)基質(zhì)時(shí)，加入硒溶液中適宜的硒濃度應(yīng)在1 μg·mL-1以下.

2.2.4 不同硒濃度處理對(duì)大豆根系生物量的影響 在測(cè)定大豆葉片生物量的基礎(chǔ)上，對(duì)大豆根系生物量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6.當(dāng)蛭石中加入硒溶液的硒濃度在0～0.5 μg·mL-1時(shí)，大豆苗葉片生物量隨著硒濃度的增加而增加，但無(wú)極顯著差異.當(dāng)硒濃度大于0.5 μg·mL-1時(shí)，大豆苗凈增根系生物量隨著硒濃度升高而降低，并呈極顯著的負(fù)相關(guān)(r=|-0.911|>0.75，y=-2.222 4x+14.434 63，y表示蛭石中加入硒溶液硒的濃度，x表示大豆苗根系生物量)且具有極顯著差異，當(dāng)硒濃度達(dá)10 μg·mL-1時(shí)，與對(duì)照相比出現(xiàn)極顯著差異，表現(xiàn)出嚴(yán)重的中毒狀況.因此，從根系生物量這個(gè)生物量來(lái)考察，在采用蛭石作為培養(yǎng)基質(zhì)時(shí)，加入硒溶液中適宜的硒濃度應(yīng)在0～0.5 μg·mL-1.

圖5 不同硒濃度處理對(duì)大豆葉片生物量的影響 圖6 不同硒濃度處理對(duì)大豆根系生物量的影響

2.3 不同硒濃度處理對(duì)大豆可溶性蛋白及可溶性糖的影響

在植物生長(zhǎng)發(fā)育中，可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)部分體現(xiàn)著機(jī)體的衰老程度.大豆在蛭石培養(yǎng)中經(jīng)不同濃度的硒處理，其可溶性蛋白含量也有不同，在此，對(duì)可溶性蛋白進(jìn)行了測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)圖7.所有不同硒濃度處理栽培的大豆的可溶性蛋白質(zhì)含量都要高于對(duì)照.當(dāng)硒處理濃度在0～1 μg·mL-1時(shí)，隨著硒處理濃度的增加，可溶性蛋白含量呈增加趨勢(shì)，并無(wú)極顯著差異；當(dāng)硒處理濃度大于1 μg·mL-1時(shí)，隨著硒處理濃度的增加，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈明顯的上升趨勢(shì)，并且有極顯著差異.因此，從可溶性蛋白這個(gè)生物量來(lái)考察，在采用蛭石作為培養(yǎng)基質(zhì)時(shí)，加入硒溶液中適宜的硒濃度應(yīng)在1 μg·mL-1以下.植物在個(gè)體發(fā)育的各個(gè)時(shí)期碳水化合物的含量也隨之變化.另外植物為了適應(yīng)逆境條件，也會(huì)主動(dòng)積累一些可溶性糖，以適應(yīng)外界環(huán)境條件的變化.對(duì)大豆苗施以不同濃度的硒處理，其可溶性糖也會(huì)隨著硒濃度的改變而改變，其結(jié)果見(jiàn)圖8.當(dāng)蛭石中加入硒溶液的硒濃度在0～1 μg·mL-1時(shí)，大豆苗葉片可溶性糖含量無(wú)極顯著差異.當(dāng)硒濃度大于為1 μg·mL-1時(shí)，大豆苗可溶性糖含量隨著硒濃度升高而升高，并呈極顯著的正相關(guān)(r=0.992097>0.75，y=9.766728x-0.51092，y表示蛭石中加入硒溶液硒的濃度，x表示大豆苗可溶性糖含量)且具有極顯著差異.因此，從可溶性糖含量這個(gè)生物量來(lái)考察，蛭石培養(yǎng)大豆中硒的適宜濃度應(yīng)在1 μg·mL-1以下.

圖7 不同硒濃度處理對(duì)大豆可溶性蛋白的影響 圖8 不同硒濃度處理對(duì)大豆可溶性糖的影響

2.4 不同硒濃度處理對(duì)大豆脯氨酸及丙二醛的影響

脯氨酸是植物體內(nèi)主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，在逆境條件下植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加，因此其脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性強(qiáng)弱的大小，測(cè)定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo).本實(shí)驗(yàn)對(duì)大豆用不同的硒濃度處理，測(cè)定其脯氨酸含量的濃度，其結(jié)果見(jiàn)圖9.低硒濃度處理大豆苗時(shí)，其脯氨酸含量無(wú)明顯差異，當(dāng)硒濃度升高至5 μg·mL-1時(shí)，脯氨酸含量上升，但無(wú)顯著差異.這與大豆生長(zhǎng)受逆境脅迫(硒)時(shí)，植株內(nèi)脯氨酸含量有所上升是一致的.因此，適當(dāng)補(bǔ)硒能提高大豆脯氨酸的含量，從而提高抗逆性.植物器官衰老或在逆境遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用.丙二醛(MDA)是膜脂過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映逆境受傷害的程度，因此，丙二醛(MDA)是常用的膜脂過(guò)氧化指標(biāo).為了解不同硒濃度處理下大豆脯氨酸含量，測(cè)定了丙二醛的含量(MDA)，其結(jié)果見(jiàn)圖10.經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，0～10 μg·mL-1的硒濃度處理均無(wú)顯著性差異和極顯著性差異.但從測(cè)定數(shù)據(jù)上來(lái)看，當(dāng)向蛭石中加入硒溶液的濃度超過(guò)1 μg·mL-1時(shí)，丙二醛的含量上升，說(shuō)明適宜濃度的硒能夠提高大豆的抗逆性.

圖9 不同硒濃度處理對(duì)大豆脯氨酸的影響 圖10 不同硒濃度處理對(duì)大豆丙二醛含量的影響圖

3 討論

當(dāng)用蛭石培養(yǎng)大豆時(shí)，在蛭石中補(bǔ)以適宜濃度的硒，能夠促進(jìn)大豆的生長(zhǎng)，可提高大豆體內(nèi)可溶性蛋白、可溶性糖和葉綠素的含量， 從而提高大豆的抗逆性能，還能一定程度降低丙二醛的含量，延緩大豆的衰老.蛭石中硒的適濃度為0.5～1 μg·mL-1時(shí)，對(duì)大豆的生長(zhǎng)和硒的積累是最有利的，這相對(duì)于水培時(shí)的濃度要大，而相對(duì)于土培時(shí)的濃度要小，這說(shuō)明蛭石對(duì)硒有一定的吸附能力，但吸附強(qiáng)度沒(méi)有土壤大.由圖4可知，當(dāng)蛭石中的硒濃度超過(guò)10 μg·mL-1時(shí)，各項(xiàng)生理指標(biāo)都會(huì)下降，大豆表現(xiàn)出嚴(yán)重的中毒癥狀，這對(duì)大豆的生長(zhǎng)是非常不利的，說(shuō)明大豆在蛭石中培養(yǎng)時(shí)，硒對(duì)大豆的中毒濃度在10 μg·mL-1以上.

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