日用化工產(chǎn)品通常引起刺激性皮炎、色素沉著和變態(tài)反應(yīng)性皮炎等皮膚疾病，在化妝品所引起的病例中占到了95％以上。因此，皮膚刺激／腐蝕試驗是化妝品總體安全評價程序的一部分，特別是對于可能引起皮膚刺激或腐蝕作用的化妝品特殊組份，進(jìn)行皮膚刺激／腐蝕試驗十分必要。世界各國都把化妝品及其原料的皮膚刺激／腐蝕試驗列為化妝品安全評價的檢測內(nèi)容。
　　
　　一、化妝品的局部皮膚毒性反應(yīng)
　　
　　皮膚暴露于外源物質(zhì)(包括化學(xué)品、藥物或化妝品)可引起多種皮膚反應(yīng)，反應(yīng)早期通常是因皮膚屏障功能破壞而出現(xiàn)的皮膚干燥(水分失丟)，然后形成紅斑和水腫為特征的皮膚刺激反應(yīng)；還有一部分是由于過敏導(dǎo)致的接觸過敏和色素沉著。據(jù)報道，職業(yè)因素和化妝品引起的皮膚病中接觸性皮炎約占90％以上，其中全部接觸性皮炎病例中約70％為皮膚刺激性反應(yīng)。臨床上引起兩種不同類型的炎癥反應(yīng)過程：刺激性和變態(tài)反應(yīng)性皮炎。通常皮膚接觸化學(xué)物質(zhì)后，可觀察和辨別到幾種非免疫性的反應(yīng)形式：
　　皮膚刺激性是指皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的局部可逆性損傷，皮膚刺激反應(yīng)一般無免疫系統(tǒng)的參與，其典型表現(xiàn)是紅斑或水腫。皮膚腐蝕性指的是不可逆損傷，典型表現(xiàn)是潰瘍、出血和血痂，以及由于皮膚漂白出現(xiàn)的脫色、脫發(fā)和疤痕。國際法規(guī)強(qiáng)制要求化學(xué)品上市前必須進(jìn)行皮膚腐蝕性評價。但是腐蝕性并不是化妝品使用中希望發(fā)生的現(xiàn)象，只是由于制造商失誤或消費(fèi)者誤用的情況下偶然發(fā)生的情況。另一方面，化妝品原料也可能本身具有腐蝕性，但在化妝品中并不排斥使用，因此終產(chǎn)品腐蝕性的大小與下列因素密切相關(guān)：化妝品中腐蝕物質(zhì)的終濃度、中和物質(zhì)的有無、賦形劑的使用、暴露途徑以及使用條件等。
　　累積性刺激是重復(fù)暴露于外源物質(zhì)發(fā)生的可逆刺激反應(yīng)，接觸此類物質(zhì)引起的皮膚變化較緩慢，如皮膚增厚、皺紋產(chǎn)生和色素沉著等，這些變化是皮膚炎癥的間接效應(yīng)。
　　
　　二、體內(nèi)動物實(shí)驗
　　
　　傳統(tǒng)皮膚刺激和腐蝕試驗多采用動物進(jìn)行。單次體內(nèi)皮膚刺激試驗一般用兔進(jìn)行，每次試驗至少選擇4只健康的成年動物。如預(yù)期有刺激反應(yīng)，初試應(yīng)考慮使用1只動物。如沒有出現(xiàn)明顯的陽性反應(yīng)(紅斑或水腫記分大于2)時，應(yīng)至少再使用2只動物進(jìn)行試驗。如預(yù)期無反應(yīng)，初試可使用3只動物。在使用了至少3只動物后，如仍為疑似反應(yīng)或不明確，應(yīng)考慮進(jìn)行復(fù)試。
　　多次體內(nèi)皮膚刺激試驗是指在7～14天內(nèi)對實(shí)驗動物進(jìn)行重復(fù)皮膚染毒，對檢測化妝品刺激性的效果比單次染毒效果好，特別適用于與皮膚長期密切接觸的或反復(fù)使用的個人護(hù)理產(chǎn)品。每次試驗選擇三組以上的動物，每組動物雌雄各5～10只，各組分別接受不同劑量的受試物進(jìn)行測試。根據(jù)產(chǎn)品的性質(zhì)和用途，多次皮膚刺激試驗進(jìn)行染毒程序、方式和次數(shù)的調(diào)整。
　　體內(nèi)皮膚腐蝕試驗與刺激試驗采用同一試驗程序，不同之處在于動物反應(yīng)程度的差異。對于預(yù)期具有腐蝕性的受試物，強(qiáng)烈建議只用一只動物進(jìn)行初次試驗。先后施用共3次斑貼，第一次斑貼在貼敷3min后去除。如果未觀察到嚴(yán)重皮膚反應(yīng)，則在不同的位點(diǎn)施用第二次斑貼，1h后去除。如果此時觀察的結(jié)果表明動物能夠忍受第三次暴露造成的痛苦，則第三次應(yīng)在4h后去除斑貼。記錄每個時間點(diǎn)的反應(yīng)程度。如果在連續(xù)的3次暴露后的任何一次觀察到腐蝕效應(yīng)(如潰瘍、出血)，則試驗立即終止，如果最后一次斑貼去除后，仍未觀察到腐蝕效應(yīng)，動物應(yīng)觀察到14天。
　　為了提高皮膚評價試驗的科學(xué)性，更好的體現(xiàn)3R原則，2002年版的OECD指南對皮膚刺激性的動物試驗的有關(guān)條款進(jìn)行了優(yōu)化，采用新的試驗策略，可以避免和減少不必要的動物皮膚刺激／腐蝕試驗。這一策略基于如下階梯式順序：現(xiàn)有資料分析，pH值測定，使用經(jīng)驗證和接受的體外方法，最后進(jìn)行對動物試驗優(yōu)化。在下列4種情況下，可不考慮進(jìn)行皮膚腐蝕試驗：①根據(jù)結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系或理化特性推斷可能具有皮膚腐蝕性的物質(zhì)，如強(qiáng)堿或強(qiáng)酸類，pH≤2.0或pH≥11.5；②經(jīng)急性經(jīng)皮毒性試驗顯示具有很強(qiáng)系統(tǒng)毒性的物質(zhì)；③經(jīng)腐蝕性試驗的替代試驗(如TER法、皮膚模型試驗)的其中一種方法證明具有腐蝕性的物質(zhì)；④急性經(jīng)皮毒性試驗中，染毒劑量達(dá)2000mg／kg時仍未產(chǎn)生皮膚刺激體征的物質(zhì)。對于非腐蝕性物質(zhì)也只有必要時才進(jìn)行體內(nèi)皮膚刺激試驗。
　　
　　三、體內(nèi)人體皮膚刺激試驗
　　
　　人體皮膚貼斑試驗包括單次、多次和加強(qiáng)暴露刺激試驗等多種，其目的是檢測受試物引起人體不良反應(yīng)的可能性。人體試驗一般是用來決定產(chǎn)品或配方的“皮膚相對兼容性”和進(jìn)行局部“暴露”的風(fēng)險評價，以證明這種物質(zhì)應(yīng)用于化妝品中第一次接觸人皮膚或粘膜時對人體無損害。然而，如果只是為了危害評估，化妝品人體志愿者測試獲得的數(shù)據(jù)存在一些特定的偶然性。
　　單次刺激斑貼試驗是評價化妝品對皮膚刺激性的經(jīng)典方法之一，通常采用芬蘭斑試器(Finn chamber)或不同直徑的Hilltop斑試器。實(shí)驗方法有局部全封閉斑貼法和局部半封閉斑貼法，區(qū)別在于前者完全不透氣，后者使用半封閉敷料固定，接觸時間通常為24～48h?？筛鶕?jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。
　　對于使用頻繁的化妝品多次刺激貼斑試驗更有價值，因為某些化學(xué)物接觸皮膚一次不產(chǎn)生刺激反應(yīng)，但接觸皮膚多次卻可能引發(fā)強(qiáng)烈的刺激反應(yīng)。多次斑貼試驗可評估化妝品是否會引起累積性刺激反應(yīng)或變應(yīng)性接觸性皮炎?？筛鶕?jù)產(chǎn)品用途在指南原則下調(diào)整產(chǎn)品的皮膚接觸時間、涂抹劑量、間隔時間和重復(fù)接觸次數(shù)。
　　除了上述常規(guī)的皮膚斑貼試驗外，還有幾種改進(jìn)的試驗方法用于特殊用途化妝品的檢測。皮膚劃痕試驗是一種用受損皮膚評估化妝品刺激反應(yīng)的方法，肥皂小室試驗專門用來研究肥皂是否導(dǎo)致皮膚干裂和剝落的一種試驗，彎曲洗滌試驗或肘關(guān)節(jié)彎曲洗滌試驗主要應(yīng)用于評估肥皂和去污劑接觸人體皮膚產(chǎn)生刺激反應(yīng)的情況。這些試驗方法在產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)控和檢驗評估過程中都有被應(yīng)用。
　　人體志愿者的斑貼試驗與體內(nèi)動物實(shí)驗的觀察和分級是類似的，也包括紅斑、水腫、水皰和焦痂等反應(yīng)，具體分級及評估法可參考有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。除了主觀性較強(qiáng)的肉眼評判外，還可借助檢測儀器提高結(jié)果評價的客觀性，如經(jīng)皮膚水分流失(TEWL)和皮膚水份含量等。
　　志愿者的測試實(shí)際上是一種小樣本的人群流行病學(xué)調(diào)查，因而其結(jié)果用于預(yù)測化妝品應(yīng)用到普通人群的情況存在不足，除了樣本量的限制，對實(shí)驗條件的控制也存在一定的難度，包括不同受試個體的皮膚可能存在差異、試驗時使用的封閉涂抹條件與產(chǎn)品實(shí)際使用存在差異、不同試驗環(huán)境條件存在差異等。
　　
　　四、已認(rèn)可的皮膚刺激試驗體外方法
　　
　　經(jīng)過近20年的皮膚刺激試驗體外替代方法的研究，目前，經(jīng)過驗證和認(rèn)可的體外方法主要是人工皮膚模型法，該方法于2010年經(jīng)OECD認(rèn)可為指南439。
　　
　　1、EpiSkin模型試驗
　　EpiSkin是一種三維人體皮膚模型，由法國里昂的EPISKIN-SNC公司開發(fā)。用于替代皮膚刺激試驗時，直接將測試物質(zhì)局部應(yīng)用于皮膚表面，然后用MTT法評價測試物對細(xì)胞活性的作用，以百分比細(xì)胞活性為檢測終點(diǎn)用于區(qū)分皮膚刺激物和非刺激物。商品化的皮膚刺激檢測試劑盒含培養(yǎng)基、試劑和12個表皮單位，表皮單位由具有屏障功能的重建表皮組成?？梢詸z測所有劑型的化學(xué)物質(zhì)，包括粉劑、液體、分散劑等。將受試化妝品(10uL，mg)涂抹于人工皮膚表面，作用30min后，去除受試物，繼續(xù)孵育42小時，用MTT法測試細(xì)胞存活率，必要時輔以IL-1α測定。判斷標(biāo)準(zhǔn)：與對照組相比細(xì)胞活性>50％表明受試物無刺激性，細(xì)胞活性≤50％，表明受試物具有刺激性。
　　
　　2、EpiDerm^TM模型試驗
　　EpiDerm重建皮膚模型，由位于美國馬里蘭州阿什蘭德的MatTek公司研發(fā)并生產(chǎn)。EpiDerm皮膚模型由來源于人皮膚的角質(zhì)細(xì)胞生長于特殊制備的Millicell細(xì)胞嵌入培養(yǎng)板中，形成多層分化的人類表皮模型，模型由基底層、棘層、顆粒層和角化層組成，與體內(nèi)皮膚結(jié)構(gòu)類似。以EPI-200為例，試劑盒含24塊人工皮膚組織，培養(yǎng)10天的人工皮膚以特殊制備的嵌入板為支持物，嵌入板包埋于含營養(yǎng)液的瓊脂糖凝膠中便于運(yùn)輸，試劑盒還包括維持培養(yǎng)基和MTT檢測成分。早期的判定方案是通過測定ET5值(接觸化合物后使組織活性下降50％所需的暴露時間)，通過與陽性對照相比來評估評估化合物的刺激性和非刺激性。后來，采納了與EpiSkin類似的方案，即與陰性對照組相比，細(xì)胞活性<50％表明受試物具有刺激性。
　　
　　3、SkinEthi^TM模型試驗
　　Skinethic是由位于法國尼斯的SkinEthic公司開發(fā)的人工皮膚模型。采用無血清培養(yǎng)基制備，制備過程是由培養(yǎng)人正常角質(zhì)細(xì)胞于聚碳酸酯嵌入培養(yǎng)板，經(jīng)氣一液界面培養(yǎng)17天完全分化形成表皮結(jié)構(gòu)。產(chǎn)品的質(zhì)量控制，包括組織學(xué)觀察和組織活性測定(MTT試驗)，如果OD值大于0.8，且組織學(xué)觀察切片顯示至少4層活性細(xì)胞層。已提出基于該方法的二步法急性和累積性刺激篩選系統(tǒng)，受試物作用30min后，去除受試物，再孵育42h檢測組織活性，如果細(xì)胞活性<50％表明受試物具有刺激性。如果增加IL-1釋放和形態(tài)學(xué)改變作為檢測終點(diǎn)可提高檢測的敏感性。
　　
　　五、已認(rèn)可的皮膚腐蝕試驗的替代方法
　　
　　皮膚腐蝕試驗體外方法的前驗證研究始于1994，經(jīng)過10多年的努力，到2004年，國際社會基本接受的皮膚腐蝕試驗的體外方法，主要有3項，分別是大鼠經(jīng)皮電阻試驗(TER)、CORROSITEX測試和人工皮膚模型試驗(Episkin試驗和EpiDerm試驗)。
　　
　　1、人工皮膚模型試驗
　　體外重建皮膚模型EpiSkin是在膠原蛋白支持物上用人角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)的一種多層人體皮膚模。將受試物直接與EpiSkinI^TM模型作用3、60和240min 3個時間，用MTT法檢測受試物對細(xì)胞存活率的影響，陽性對照為冰醋酸或KOH，陰性對照為生理鹽水。陰性對照的細(xì)胞相對活性設(shè)定為100％，每一樣品測得的OD值與陰性對照相比，求出樣品的細(xì)胞相對活性百分比，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定：受試物作用3min后，皮膚細(xì)胞活性≤35％，判定為EUR35類；受試物作用3min后，皮膚細(xì)胞活性≥35％，作用1h后細(xì)胞活性<35％，判定為R34類；受試物作用4h后，皮膚細(xì)胞活性≥35％，結(jié)論為沒有腐蝕性。
　　皮膚模型EpiDerm是用正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(NHK)培養(yǎng)而成的一種多層皮膚模型，它包含基底層、棘層、微粒層和一層內(nèi)含細(xì)胞間脂質(zhì)的角質(zhì)層。將受試物加在皮膚模型上3min～1h，然后用MTT法測定受試物的細(xì)胞毒性。暴露時間為3min和1h。陽性對照為冰醋酸或KOH，陰性對照為生理鹽水。陰性對照的細(xì)胞相對活性設(shè)定為100％，每一樣品測得的OD值與陰性對照相比，求出樣品的細(xì)胞相對活性百分比，根據(jù)腐蝕性判定標(biāo)準(zhǔn)判斷受試物是否具有腐蝕性。EpiDerm^TM模型的腐蝕性判定標(biāo)準(zhǔn)為：①受試物具有腐蝕性：受試物作用3min后，皮膚細(xì)胞活性<50％；或受試物作用3min后，皮膚細(xì)胞活性≥50％，而且作用1h后細(xì)胞活性<15％。②受試物沒有腐蝕性：受試物作用3min后，皮膚細(xì)胞活性I≥50％，而且作用1h后細(xì)胞活性≥15％。
　　
　　2、大鼠皮膚經(jīng)皮電阻試驗
　　以經(jīng)皮電阻值為檢測終點(diǎn)，通過檢測受試物對大鼠離體皮膚角質(zhì)層完整性和屏障功能的損害能力，評定受試物的腐蝕性。選用28～30天齡的wister大鼠的背部皮膚制作皮膚薄片。將其固定于PTFE管的末端，另一端連接電極。直接涂抹受試物與皮膚薄片作用24h后，去除受試物，用電極測量經(jīng)皮電阻。陽性對照用HCL溶液，陰性對照選用蒸餾水。經(jīng)皮電阻值>5kΩ，評定該受試物無腐蝕性；如經(jīng)皮電阻≤5kΩ，而且該受試物不是表面活性物質(zhì)或中性有機(jī)溶劑，評定受試物具有腐蝕性；如果受試物為表面活性物質(zhì)或中性有機(jī)溶劑，經(jīng)皮電阻≤5kΩ，可增加硫丹明B染色劑穿透試驗，以確定是否出現(xiàn)假陽性。
　　
　　3、CORROSITEXTM皮膚腐蝕試驗
　　CORROSITEX試驗體系由人造的大分子生物膜和檢測系統(tǒng)(CDS)兩部分組成。蛋白大分子水凝膠生物膜模擬皮膚的正常功能，假定腐蝕性物質(zhì)作用于生物膜與作用于活體皮膚的機(jī)制相似，將受試物作用于人工膜屏障的表面，檢測由腐蝕性受試物引起的膜屏障損傷。通過多種方法檢測膜屏障的滲透性，包括pH指示劑顏色的改變和指示劑溶液其它特性的改變。受試物開始作用于膜屏障到膜屏障滲透改變之間經(jīng)過的時間(以min計)作為受試物腐蝕性分類和UN化學(xué)品包裝分類(如果適用)的依據(jù)。對每一個試驗方法，都有三種腐蝕性分類的截止時間值。根據(jù)截止時間對受試物腐蝕性的判定應(yīng)當(dāng)使腐蝕性危害最小化，即減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。Corrositex最早由美國運(yùn)輸部認(rèn)可用于危害化學(xué)物分類，ICCVAM認(rèn)可其對酸、堿衍生物，以及以其為主要成份的配方的檢測。該方法已經(jīng)過驗證，并被推薦為評估化學(xué)品皮膚腐蝕性危害分級測試策略的一部分。
　　
　　六、未認(rèn)可的體外皮膚刺激/腐蝕試驗方法
　　
　　1、離體皮膚模型試驗
　　利用離體兔、人類或豬皮皮膚進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)的局部皮膚毒性試驗，試驗采用嵌入式培養(yǎng)模型，檢測終點(diǎn)采用MTT法，通過定量測定受試物作用皮膚不同時間后的效應(yīng)，可用于區(qū)分急性和遲發(fā)性毒性作用，延長培養(yǎng)時間至7天，還可以區(qū)分化學(xué)品的不可逆的有害作用。離體皮膚可來自兔、豬或人，制備方法見第三節(jié)，將制備好的離體皮膚模型，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，更換新的培養(yǎng)液。測試化合物局部涂抹于皮片表面，作用4小時。除去測試化合物后，分別于0、24和48小時檢測MTT。此外，根據(jù)實(shí)驗?zāi)康?，還可檢測表皮細(xì)胞的增殖、中性紅攝取和羥基脂肪酸釋放。
　　
　　2、非灌注豬耳試驗
　　將豬耳暴露于試驗物質(zhì)，通過檢測皮膚表面跨表皮水份丟失(TEWL)的絕對增加值，可用于區(qū)分受試物的刺激性和非刺激性。如果TEWL值大于6g／m2／h，則評定受試物具有刺激性。該方法在進(jìn)行Ⅰ期和Ⅱ期驗證的時候效果并不是特別的好，經(jīng)改進(jìn)后進(jìn)入Ⅲ期，所得結(jié)果的變異太大，目前試驗方案仍在改進(jìn)中。
　　
　　3、小鼠皮膚完整性功能試驗
　　將小鼠皮膚暴露于受試物一段時間后，用2種方法用于評估角質(zhì)層的完整性，即跨表皮水分丟失(TEWL)和經(jīng)皮電阻(ER)。SIFT預(yù)測模型的基礎(chǔ)是比較應(yīng)用測試物前后TEWL或ER的值，以大于或小于5倍說明測試物有或無刺激性。使用時，將受試物涂抹于小鼠完整皮膚上，作用一段時間后，測定接觸受試物TEWL和電阻(ER)的大小，按下列公式計算TEWL比值和ER比值，評定受試物是否具有刺激性。正常小鼠完整皮膚模型的TEWL值為3～10(g／m²)，ER值為5～20kΩ。
　　
　　4、結(jié)構(gòu)－活性關(guān)系
　　化合物的皮膚刺激或腐蝕性反應(yīng)的發(fā)生與其特定的化學(xué)功能基團(tuán)或其分子結(jié)構(gòu)直接相關(guān)，通過建立已知的皮膚刺激性／腐蝕性物質(zhì)與其分子結(jié)構(gòu)的可測量的參數(shù)之間的相互聯(lián)系的模型，可將某一未知毒性反應(yīng)終點(diǎn)的化學(xué)物的分子結(jié)構(gòu)與之進(jìn)行比較來預(yù)測未知化學(xué)物的反應(yīng)終點(diǎn)。例如，通過對已知腐蝕性和非腐蝕性的酸、堿、親電子試劑和某些中性有機(jī)物進(jìn)行分析，提出了皮膚腐蝕性的QSAR模型。有的模型分析了不同種類的一組有機(jī)化合物，根據(jù)其熔點(diǎn)(Mpt)和分子重量(MW)，按照以下的預(yù)測模型(PM)可以預(yù)測為腐蝕物或非腐蝕物，如果Mpt≥37℃且MW≤123g／mol，預(yù)測為皮膚腐蝕物，否則預(yù)測為非腐蝕物。
　　
　　結(jié)語
　　
　　化妝品皮膚腐蝕的替代方法已被驗證和被EU和OECD法規(guī)接受，所以從這一點(diǎn)上，動物試驗是不能再進(jìn)行了。皮膚刺激性的體外方法已通過驗證，并正式列入OECD指南草案，有望在2年內(nèi)正式發(fā)布成為新的試驗指南?；瘖y品皮膚刺激性／腐蝕性的危害識別(或分類和標(biāo)識)應(yīng)采用逐層的策略，第一層是通過QSAR模型或?qū)＜蚁到y(tǒng)預(yù)測皮膚的刺激性／腐蝕性，然后基于pH測試和現(xiàn)有的皮膚吸收或急性毒性的數(shù)據(jù)，第二層是采用已驗證的替代試驗(大鼠皮膚TER檢測、人體皮膚模型試驗、CORROSITEX)或其它允許使用的體外方法，其結(jié)果可作為皮膚刺激性或腐蝕性的判定依據(jù)。上述試驗為陰性的物質(zhì)，必要時可進(jìn)入第三層，進(jìn)行4小時人體皮膚斑貼試驗。因此，現(xiàn)有的體外方法可以完全替代動物測試，不僅可用于化妝品研發(fā)過程中原料和成品配方的日常評估，還可應(yīng)用于法規(guī)監(jiān)管目的。
　　致謝：本項目得到廣東省科技攻關(guān)項目的資助(20098060300013)
　　
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