張新超 郭麗瓊 林俊芳 雷韻祺

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系，廣東 廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)能研究所，廣東 廣州 510640；3.廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東 中山 528415）

猴頭菌固體發(fā)酵基質(zhì)的抗氧化活性成分研究

張新超1，3郭麗瓊1，2林俊芳1，2雷韻祺1

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系，廣東 廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)能研究所，廣東 廣州 510640；3.廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東 中山 528415）

選用燕麥、大豆、玉米、麩皮、大米、蕎麥6種培養(yǎng)基質(zhì)，對(duì)猴頭菌進(jìn)行固體發(fā)酵及抗氧化活性研究。結(jié)果表明：猴頭菌最佳抗氧化發(fā)酵基質(zhì)為蕎麥大豆培養(yǎng)基（蕎麥79.13%，大豆20.87%），最佳發(fā)酵條件為溫度30℃，培養(yǎng)料粒度40目，培養(yǎng)基含水量70%，初始pH值4，接種量4.5%，發(fā)酵時(shí)間12d。猴頭菌蕎麥發(fā)酵基質(zhì)抗氧化活性成分種類(lèi)豐富，含量高，其中總黃酮物質(zhì)87.13μg／g，總?cè)?.58mg／g，多酚4.51mg／g，還原糖 21.53mg／g，花色苷68.96μg／g，VC14.07mg／g，VE205.85μg／g，GSH 853.65mg／g，SOD 酶活性293.57U／g。

猴頭菌；固體發(fā)酵；發(fā)酵基質(zhì)；抗氧化成分

人類(lèi)和動(dòng)物持續(xù)暴露在活性氧與促氧化劑中，很容易引起機(jī)體組織發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致機(jī)體代謝性功能的紊亂以及一系列的慢性疾病，如癌癥、血脂異常等［1］。食用一些富含具有抗氧化生物活性物質(zhì)的功能性食品，可以延緩或預(yù)防機(jī)體組織氧化應(yīng)激損傷。食藥用菌以其較強(qiáng)的生理功能和較小的毒副作用的特性，被越來(lái)越廣泛采用。

猴頭菌是著名的食用、藥用真菌，素稱(chēng)“蘑菇之王”，它與熊掌、燕窩、魚(yú)翅并列為四大名菜，自古以來(lái)被譽(yù)為“山珍”。猴頭菌富含多種有益菌多糖和人體必需氨基酸以及微量元素（如Fe、Cu、Zn、Se等），此外還含有多種抗氧化成分［2］。中國(guó)已經(jīng)廣泛用于醫(yī)治消化不良、胃潰瘍、食道癌、胃癌、十二指腸潰瘍、肛門(mén)癌等消化系統(tǒng)的疾病與腫瘤的治療［3］。

目前對(duì)猴頭菌的抗氧化功能研究?jī)H僅停留在其子實(shí)體或菌絲體成分分析階段。本試驗(yàn)選用燕麥、大豆、玉米、麩皮、大米、蕎麥6種培養(yǎng)基對(duì)猴頭菌進(jìn)行固體發(fā)酵研究，分析其發(fā)酵基質(zhì)的抗氧化成分，為開(kāi)發(fā)猴頭菌功能性菌質(zhì)食品提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菌：購(gòu)于山東壽光食用菌研究所；

燕麥、大豆：市售；

2，2－聯(lián)氮－二（3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸）（ABTS）、VE標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥96%，以α－生育酚計(jì)）、蘆丁標(biāo)品、齊墩果酸標(biāo)品、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（L－抗壞血酸）：Sigma Aldrich公司；

還原型谷胱甘肽 （GSH）試劑盒：南京建成生物工程研究所；

其余試劑：均為市售分析純。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200g／L、葡萄糖20g／L、磷酸氫二鉀3g／L、硫酸鎂1.5g／L、葡萄糖 20g／L、瓊脂20g／L，蒸餾水定容，高壓滅菌后備用。

猴頭菌母種經(jīng)活化后接種于PDA平板并置于30℃培養(yǎng)7d，然后在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基（玻璃組培瓶，高10cm，直徑6.5cm）中，30℃培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 最優(yōu)抗氧化培養(yǎng)基的確定 以大米、燕麥、大豆、麩皮、玉米、蕎麥為基本培養(yǎng)料，按照猴頭菌所需碳氮比（27∶1）。運(yùn)用design expert 7.0軟件選用 mixture design的單型格子設(shè)計(jì)，以生長(zhǎng)速度和總自由基清除率為響應(yīng)值確定最佳抗氧化培養(yǎng)基。

1.3.2 總自由基清除率測(cè)定

（1）浸提液的提?。簠⒄瘴墨I(xiàn)［4］的方法并作改進(jìn)。將發(fā)酵后的固體菌質(zhì)60℃烘干，粉碎，過(guò)60目篩，精確稱(chēng)取1.000g，加入95%乙醇10mL，25℃以200r／min搖床旋轉(zhuǎn)下萃取24h，離心（6 000g，5min），上清液即為醇提液。剩余殘?jiān)?0mL水，25℃下以200r／min搖床旋轉(zhuǎn)萃取24h，離心（6 000g，5min），取上清液即為水提液。

（2）自由基清除率測(cè)定：采用 ABTS法［5］。

1.3.3 最佳發(fā)酵條件的確定 在培養(yǎng)料未分粒度，培養(yǎng)料含水量為60%，接種量為1.5%，發(fā)酵溫度為30℃，培養(yǎng)基初始pH值自然的基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵溫度（20，25，28，30，32，35℃）、培養(yǎng)料粒度（10，20，30，40，60目）、培養(yǎng)基含水量（50%，60%，65%，70%）、培養(yǎng)基初始pH 值（4，5，6，7，8，9）、接種量（1.5%，3%，4.5%，6%，7.5%）進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的發(fā)酵條件。

1.3.4 抗氧化成分測(cè)定 發(fā)酵結(jié)束后，將猴頭菌發(fā)酵基質(zhì)置于烘箱60℃下烘干，粉碎過(guò)60目篩，備用。未發(fā)酵基質(zhì)滅菌（121℃，30min）后置于烘箱60℃下烘干，粉碎過(guò)60目篩，備用。

（1）總黃酮的測(cè)定：參照文獻(xiàn)［6］的方法進(jìn)行。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝5.112 5x＋0.006 6，R2＝0.999 6。

（2）總多酚的測(cè)定：參照文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝0.025 1x＋0.045 4，R2＝0.996 2。

（3）總?cè)频臏y(cè)定：總?cè)频奶崛⒖嘉墨I(xiàn)［8］的方法并有所改進(jìn)。稱(chēng)?。?.250 0±0.000 2）g，加入三氯甲烷100mL回流提取1h，冷卻，于45℃減壓回收至干，加15mL飽和NaHCO3溶液洗至分液漏斗，再用6mol／L的HCl調(diào)節(jié)pH值至3～4，后用氯仿（CHCl3與NaHCO3體積比為1∶2）萃取，收取氯仿層（下層），減壓蒸干氯仿，加甲醇定容至10mL的容量瓶刻度。

總?cè)频臏y(cè)定參照文獻(xiàn)［9］的方法進(jìn)行。以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝4.822x－0.006 6，R2＝0.992 8。

（4）還原糖的測(cè)定：采用 DNS法［10，11］。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝0.533 3x－0.009 6，R2＝0.998。

（5）VC的測(cè)定：參照文獻(xiàn)［12］的方法進(jìn)行。以L－抗壞血酸為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝0.105 2x－0.110 7，R2＝0.999。

（6）VE的測(cè)定：參照文獻(xiàn)［13］的方法進(jìn)行。以α－生育酚為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝2.900 5x－0.000 7，R2＝0.999 2。

（7）花色苷的測(cè)定：參照文獻(xiàn)［14］的方法進(jìn)行。

（8）內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)（GSH、SOD）的測(cè)定：谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）樣品液的提取參照Chung等的方法［15］進(jìn)行。還原型谷胱甘肽的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，GSH含量的單位為 mg／g；SOD的測(cè)定參照Beyer等的方法［16］進(jìn)行。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 樣品測(cè)定采用6個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±S）表示，運(yùn)用Excel 2003軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)培養(yǎng)基配方的確定

猴頭菌在不同培養(yǎng)基質(zhì)的生長(zhǎng)速度及發(fā)酵后基質(zhì)的總自由基清除率結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，配方5生長(zhǎng)速度與配方1、2、3、4、6、7差異均不顯著（P＜0.05），與其他配方差異顯著（P＜0.05）；總自由基清除率與其他配方差異均顯著（P＜0.05），最終選定配方5為最優(yōu)抗氧化培養(yǎng)基即蕎麥大豆培養(yǎng)基。培養(yǎng)基組成成分為：蕎麥79.13%，大豆20.87%。

2.2 最佳發(fā)酵條件的確定

2.2.1 溫度對(duì)發(fā)酵的影響 猴頭菌在不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵后基質(zhì)的自由基清除率和生長(zhǎng)速度見(jiàn)圖1。

由圖1可知，猴頭菌30℃生長(zhǎng)速度與其他溫度差異均顯著（P＜0.05）；自由基清除率與其他溫度差異均顯著（P＜0.05），最終選定溫度30℃為猴頭菌最優(yōu)發(fā)酵溫度。

2.2.2 培養(yǎng)料粒度對(duì)發(fā)酵的影響 猴頭菌在不同培養(yǎng)料粒度下發(fā)酵后基質(zhì)的自由基清除率和生長(zhǎng)速度見(jiàn)圖2。

由圖2可知，猴頭菌40目，生長(zhǎng)速度與20，30目呈現(xiàn)不顯著差異（P＜0.05），與10，60目差異顯著（P＜0.05）；自由基清除率與其他均呈顯著差異（P＜0.05）。最終選定培養(yǎng)料粒度40目為猴頭菌最優(yōu)培養(yǎng)料粒度。

表1 培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)猴頭菌生長(zhǎng)速度及總自由基清除率的影響 Table 1 Influence of the mixture composition on the growth rate and the radical scavenging activity during solid cultivation of Hericium erinaceum

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)猴頭菌發(fā)酵后基質(zhì)的自由基清除率和生長(zhǎng)速度的影響Figure 1 Influence of fermentation temperature on the radical scavenging activity and the average growth speed during solid cultivation of Hericium erinaceum

圖2 培養(yǎng)料粒度對(duì)猴頭菌發(fā)酵后基質(zhì)的自由基清除率和生長(zhǎng)速度的影響Figure 2 Influence of material grain size on the radical scavenging activity and the average growth speed during solid cultivation of Hericium erinaceum

2.2.3 初始pH值對(duì)發(fā)酵的影響 猴頭菌在不同初始pH值下發(fā)酵后基質(zhì)的自由基清除率和生長(zhǎng)速度結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，猴頭菌pH＝5，生長(zhǎng)速度與其他均呈現(xiàn)不顯著差異（P＜0.05）；自由基清除率與pH＝6、pH＝7、pH＝9均呈不顯著差異（P＜0.05），與pH＝4、pH＝8差異顯著（P＜0.05）。但由于pH＝5時(shí)猴頭菌發(fā)酵后基質(zhì)的自由基清除率最高，故最終選定初始pH＝5為猴頭菌最優(yōu)初始pH值。

圖3 初始pH值對(duì)猴頭菌發(fā)酵后基質(zhì)的自由基清除率和生長(zhǎng)速度的影響Figure 3 Influence of initial pH on the radical scavenging activity and the average growth speed during solid cultivation of Hericium erinaceum

2.2.4 培養(yǎng)基含水量對(duì)發(fā)酵的影響 猴頭菌在不同培養(yǎng)基含水量下發(fā)酵后基質(zhì)的自由基清除率和生長(zhǎng)速度見(jiàn)圖4。

由圖4可知，猴頭菌培養(yǎng)基含水量60%，生長(zhǎng)速度與80%呈不顯著差異，與其他差異均顯著（P＜0.05）；自由基清除率與其他差異均顯著（P＜0.05）。最終選定60%為猴頭菌最適培養(yǎng)基含水量。

2.2.5 接種量對(duì)發(fā)酵的影響 猴頭菌在不同接種量下發(fā)酵后基質(zhì)的自由基清除率和生長(zhǎng)速度見(jiàn)圖5。

圖4 培養(yǎng)基含水量對(duì)猴頭菌發(fā)酵后基質(zhì)的自由基清除率和生長(zhǎng)速度的影響Figure 4 Influence of culture medium moisture on the radical scavenging activity and the average growth speed during solid cultivation of Hericium erinaceum

圖5 接種量對(duì)猴頭菌發(fā)酵后基質(zhì)的自由基清除率和生長(zhǎng)速度的影響Figure 5 Influence of inoculation on the radical scavenging activity and the average growth speed during solid cultivation of Hericium erinaceum

由圖5可知，猴頭菌接種量7.5%，生長(zhǎng)速度與3%、4.5%、6%呈不顯著差異，與1.5%差異顯著（P＜0.05）；自由基清除率與其他差異均不顯著（P＜0.05）。但由于接種量為7.5%時(shí)猴頭發(fā)酵后基質(zhì)的總自由基清除率最高，最終選定7.5%為猴頭菌最適接種量。

2.3 培養(yǎng)時(shí)間的確定

發(fā)酵時(shí)間對(duì)猴頭菌自由基清除率的結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)猴頭菌基質(zhì)自由基清除率的影響Figure 6 Influence of fermentation time on the radical scavenging activity during solid cultivation of Hericium erinaceum

由圖6可知，猴頭菌基質(zhì)自由基清除率隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)發(fā)生顯著性變化（P＜0.05），其中在12d出現(xiàn)最大，14，16d未出現(xiàn)顯著性差異，但其他時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。故選擇12d作為猴頭菌最佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.4 猴頭菌基質(zhì)抗氧化活性成分分析

猴頭菌發(fā)酵完全后，其基質(zhì)的抗氧化活性成分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，猴頭菌發(fā)酵基質(zhì)中抗氧化活性成分，與未發(fā)酵的基質(zhì)相比，總黃酮含量及還原糖含量下降明顯，總?cè)莆镔|(zhì)含量略有下降，花色苷及總多酚含量上升，VC略有下降，VE含量明顯上升，SOD酶活性提高，GSH含量上升為原來(lái)的4倍左右。

表2 猴頭菌發(fā)酵基質(zhì)抗氧化活性成分分析Table 2 The antioxidant components analysis of full fermentation substrate of Hericium erinaceum

3 討論

本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)猴頭菌在蕎麥大豆培養(yǎng)基固體發(fā)酵得到的發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行抗氧化成分分析，發(fā)酵前后各抗氧化成分含量變化明顯?？傸S酮含量的下降可能是猴頭菌生長(zhǎng)代謝中利用黃酮醇物質(zhì)（包括花色素）與還原糖發(fā)生反應(yīng)生成苷元含量降低造成，這與Gert等［17］報(bào)道相符?？?cè)莆镔|(zhì)含量略有下降的原因可能是發(fā)酵過(guò)程中猴頭菌菌絲生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分解三萜皂苷，釋放苷元以合成其他新的糖苷物質(zhì)，這與Shashi等［18］報(bào)道相符?？偠喾雍康纳仙赡苁呛镱^菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的酚類(lèi)次生代謝產(chǎn)物聚合累積所致，這與Fulgencio等［19］報(bào)道基本相符?；ㄉ蘸康纳呖赡苁呛镱^菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程中利用糖類(lèi)和色素物質(zhì)合成了花色苷，這與Jin等［20］報(bào)道相一致。還原糖的含量顯著降低與總黃酮含量的下降和花色苷含量的上升相吻合。維生素類(lèi)物質(zhì)中VC略有下降，VE含量明顯上升的原因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中通過(guò)分解VC并利用其他物質(zhì)產(chǎn)生新的VE。內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)中SOD酶活性和GSH含量的提高是發(fā)酵過(guò)程中猴頭菌菌絲生長(zhǎng)代謝過(guò)程自身產(chǎn)生的結(jié)果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，猴頭菌在蕎麥大豆基質(zhì)發(fā)酵后，基質(zhì)中抗氧化物質(zhì)含量整體提高明顯，以猴頭菌固體發(fā)酵后基質(zhì)中的抗氧化物質(zhì)開(kāi)發(fā)新型抗氧化食品切實(shí)可行，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)功能性菌質(zhì)食品提供了參考。

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Analysis of antioxidant components of solid fermented substrates withHericium erin aceum

ZHANG Xin－chao1，3GUO Li－qiong1，2LIN Jun－fang1，2LEI Yun－qi1

（1.Department of Bioengineering，College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong510640，China；2.Institute of Biomass Research，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong510640，China；3.Guangdong Pearl River Bridge Bio－Tech CO.，LTD，Zhongshan，Guangdong528415，China）

Hericium erinaceumwas cultured on the medium including oat，wheat bran，soybeans，corn，rice and buckwheat with solid－state fermentation，and then was determined the best fermentation time and was analyzed antioxidant components of substrate.The results show that the best antioxidant fermentation substrate ofHericium erinaceumwas buckwheat and soybeans complex medium （79.13%buckwheat and 20.87%soy beans），the optimum fermentation temperature for 30℃，material grain size for 40mesh，medium moisture for 70%，initial pH for 4，inoculation for 4.5%，and the best fermentation time was 12d.The antioxidant components ofHericium erinaceumsubstrate with buckwheat were rich in varieties and high in contents，such as flavonoids 87.13μg／g，total triterpenoid 2.58mg／g，total polyphenols 4.51mg／g，reducing sugar 21.53mg／g，anthocyanins 68.96μg／g，VC14.07mg／g，VE205.85μg／g，GSH 853.65mg／g，SOD activity 293.57U／g.

Hericium erinaceum；solid fermentation；cultivation substrates；antioxidant components

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.04.011

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31071837）；廣東省科技計(jì)劃（編號(hào)：2009B020201012）

張新超（1986－），男，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：selvan.zhang＠gmail.com

林俊芳

2011－04－01