張曉芹， 賈曉云， 李 濤， 李保蘭， 史迎莉， 張 紅△

(1 陜西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，陜西 咸陽712046;2 敦化市醫(yī)院病理科，吉林 敦化133700)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種危重疾病，病死率可高達(dá)20% ～30%。近年來的研究提示:細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)在SAP 發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［1］，尤其是白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)在輕癥急性胰腺炎和重癥急性胰腺炎患者血清水平存在明顯差異，因此，IL -6 的血清水平已經(jīng)作為反映SAP 嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)［2，3］。近來研究顯示IL-6 等細(xì)胞因子通過誘發(fā)其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的活化促進(jìn)炎癥的進(jìn)一步發(fā)展［4］。而急性胰腺炎時(shí)STAT3 通路是否活化、抑制STAT3 活化是否可以有效減輕急性胰腺炎的炎癥損傷值得深入研究。

腹腔內(nèi)注射大劑量L-精氨酸(L-arginine，LArg)是近年來開始使用的一種小鼠急性胰腺炎造膜方法，此法所誘導(dǎo)模型胰腺病變的程度在不同部位比較一致，與人類急性胰腺炎的病程及組織學(xué)改變相似，是研究急性胰腺炎及其防治措施的理想動物模型［5］。本課題采用20% L -Arg 復(fù)制小鼠急性胰腺炎模型，觀察急性壞死性胰腺炎模型胰腺STAT3活化程度的變化，及與SAP 進(jìn)展密切相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1［6］(monocyte chemoattractant protein-1，MCP -1)的變化，并觀察清胰湯(Qingyi decoction，QYD)對急性壞死性胰腺炎小鼠胰腺STAT3 活性的影響及對胰腺、肺損傷的治療作用，從而探討STAT3 在急性胰腺炎中的作用和清胰湯治療SAP 的分子機(jī)制。為早期預(yù)測SAP 提供有臨床價(jià)值的指標(biāo)，為清胰湯用于臨床治療急性胰腺炎提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物

健康昆明小鼠(雄性)30 只，6 ～8 周齡，體重18～25 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證書號0001442)，各組小鼠分籠飼養(yǎng)，術(shù)前12 h 禁食，不禁水，室溫飼養(yǎng)。

2 藥品、試劑和儀器

L-Arg 購于Sigma -Aldrich(A8094);清胰湯由柴胡15 g、黃芩10 g、黃連10 g、白芍15 g、木香10 g、芒硝10 g、生大黃15 g(后下)組成，加水煎煮濃縮成85 mL(1.0 kg 生藥/L)，分裝后置4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ每剐∈骃TAT3 單克隆抗體購于Santa Cruz(sc -21876 -R);HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 購于博士德試劑公司(BA1054);兔抗小鼠β-actin 單克隆抗體購于博奧森公司(bs-0061R);ECL 發(fā)光試劑盒購于博士德試劑公司(AR1170);淀粉酶試劑盒購于南京建成生物研究所;RNA 提取試劑、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑為天根公司產(chǎn)品;其它為當(dāng)?shù)卦噭┕咎峁┑姆治黾兓瘜W(xué)試劑;酶標(biāo)儀(Bio-Tek ELX808IU);Western blotting 電泳轉(zhuǎn)膜及凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio -Rad);7300型熒光定量PCR 儀(ABI)。

3 動物分組及造模

健康雄性昆明小鼠30 只(6 ～8 周齡，體重18 ～25 g)，隨機(jī)分為3 組(n=10):對照組(control);模型組(SAP);清胰湯組(SAP +QYD)。除對照組外，模型組和清胰湯治療組給予腹腔注射20% L -Arg［5］(3 g/kg，間隔1 h 再注射1 次);清胰湯治療組在第2 次腹腔注射20% L -Arg 30 min 后給予清胰湯濃縮液灌胃(10 mL/kg)，之后每天灌胃2 次。

4 標(biāo)本采集與檢測

造模后72 h 麻醉處死動物，經(jīng)下腔靜脈取血，分離血清;完整摘除胰腺、稱重，將一部分胰腺置于10%甲醛溶液浸泡固定，另一部分胰腺迅速置入液氮中，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱，待提取蛋白行Western blotting 或提取RNA 行real - time PCR 檢測。開胸取左肺組織，于10%甲醛溶液浸泡固定，右肺迅速置入液氮中，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱，待測髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性。

4.1 胰腺和肺組織的病理學(xué)變化 一部分胰腺及左肺組織經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE 染色觀察胰腺及肺病理學(xué)改變。

4.2 血清淀粉酶檢測 采用化學(xué)比色法檢測血清淀粉酶的活性。

4.3 記算胰腺濕重比 胰腺濕重比= 胰腺重量(g)/體重(g)。

4.4 肺組織MPO 檢測 取整個(gè)右肺，加緩沖液制成肺組織勻漿，10 000 r/min 4 ℃離心10 min，提取上清液，加入鄰聯(lián)茴香胺，雙氧水反應(yīng)，分光光度計(jì)470 nm 波長下掃描，記錄第30 s 和第90 s 的吸光度差值，以評價(jià)肺組織中性粒細(xì)胞浸潤程度。

4.5 Western blotting 檢測胰腺p -STAT3 的表達(dá)變化 取胰腺組織50 mg，加蛋白裂解液400 μL 勻漿，冰上放置30 min，10 000 r/min 4 ℃離心10 min，提取上清液，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量后，用5 ×loading buffer 將樣品稀釋至4 g/L;以分子量18 ～94 kD 的marker 為參照，SDS - PAGE 膠蛋白電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，封閉液(5%脫脂奶粉)中緩慢搖蕩1 h ，用TBST 洗脫，滴加Ⅰ抗［分別為β - actin(1 ∶2 000);p-STAT3(1∶500)］至PVDF 膜，4 ℃搖床上孵育過夜。TBST 漂洗3 次，每次5 min。HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG Ⅱ抗(1∶1 000 稀釋)，室溫孵育1 h。TBST 漂洗3 次，每次10 min。ECL 滴加于PVDF 膜上，在暗盒中將X 光片曝光，顯影、定影后，根據(jù)marker，進(jìn)行掃描。圖像經(jīng)GelDoc XR 軟件進(jìn)行吸光度值分析，并與內(nèi)參照β -actin 比較，以相對吸光度值代表蛋白表達(dá)量。

4.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)法檢測胰腺M(fèi)CP-1 mRNA 的表達(dá)變化 應(yīng)用PrimerExpress軟件(PE Biosystems)設(shè)計(jì)基因特異性PCR 引物序列，MCP-1 上游引物為5' -GTTGGCTCAGCCAGATGCA -3'，下游引物5' - AGCGTACTCATTGGGATCATCTTG -3';β -actin 上游引物為5' -CATCCTGCGTCTGGACCT - 3'，下游引物5' - TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'。按試劑的操作步驟提取胰腺組織中總RNA、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件(20 μL 體系):SYBR Green Mix 9 μL，cDNA(20 mg/L)4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，H2O 6 μL。擴(kuò)增條件:預(yù)熱50℃2 min，預(yù)變性95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán);以ΔCt 值表示目的基因MCP-1 相對表達(dá)量。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 胰腺和肺組織的病理學(xué)變化

如圖1 所示，對照組小鼠胰腺及肺組織光鏡下未見病變;SAP 72 h 組胰腺腺泡細(xì)胞腫脹，可見多處不同程度片狀壞死，間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤及出血。肺組織表現(xiàn)為肺泡間隔水腫、增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤;清胰湯治療組胰腺和肺組織病變明顯減輕，主要表現(xiàn)為胰腺腺泡輕度腫脹，間質(zhì)小血管擴(kuò)張、充血，有少量炎癥細(xì)胞浸潤。肺泡間隔輕度水腫、增寬，僅見少量炎癥細(xì)胞浸潤。

Figure 1. The effect of Qingyi decoction(QYD)on the pancreatic and lung morphology of mice with severe acute pancreatitis (ASP)at 72 h. A:control group;B:SAP group;C:SAP+QYD group.圖1 各組胰腺和肺組織的病理學(xué)變化

2 血清淀粉酶活性變化

如圖2 所示，SAP 誘發(fā)后，各組血清淀粉酶活性升高，與對照組相比較差異顯著(P ＜0.01);而清胰湯治療組淀粉酶的活性明顯降低，與SAP 組相比差異顯著(P ＜0.05)。

Figure 2. The effect of QYD on the amylase activity in serum of mice with acute pancreatitis. ±s.n=10. △△P ＜0.01 vs control group;* P ＜0.05 vs SAP group.圖2 各組血清淀粉酶活性變化

3 胰腺濕重比變化

如圖3 所示，SAP 誘發(fā)后，胰腺濕重比增加，與對照組相比較，差異顯著(P ＜0.05);清胰湯治療組胰腺濕重比降低，與SAP 組相比，顯著差異(P ＜0.05)。

Figure 3. The effect of QYD on the relative pancreatic weight of mice with acute pancreatitis. ±s.n=10. △P ＜0.05 vs control group;* P ＜0.05 vs SAP group.圖3 各組胰腺濕重比變化

4 肺組織MPO 變化

如圖4 所示，SAP 誘發(fā)后，肺組織勻漿MPO 水平明顯升高，與對照組相比，差異顯著(P ＜0.01);清胰湯治療組MPO 水平明顯降低，與SAP 組相比，差異顯著(P ＜0.01)。

5 胰腺p－STAT3 的表達(dá)變化

如圖5 所示，對照組小鼠胰腺未見p -STAT3 的活性表達(dá);SAP 組小鼠在胰腺炎誘發(fā)后72 h 胰腺p-STAT3 的活性表達(dá)明顯增強(qiáng);而清胰湯治療組72 h胰腺p-STAT3 的活性表達(dá)明顯少于SAP 組(n =3，P ＜0.01)。

6 胰腺組織MCP－1 mRNA 的表達(dá)變化

如圖6 所示，SAP 誘發(fā)72 h，胰腺M(fèi)CP -1 mRNA 的表達(dá)明顯升高，與對照組相比較，差異顯著(P ＜0.01);而清胰湯治療組胰腺M(fèi)CP-1 mRNA 的表達(dá)明顯降低，與SAP 組相比差異顯著(P ＜0.05)。

Figure 4. The effect of QYD on the MPO level in lung of mice with acute pancreatitis. ±s. n =10. △△P ＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs SAP group.圖4 各組肺組織MPO 水平變化

Figure 5. Expression of p-STAT3 protein in pancreas following the development of acute pancreatitis. Pancreas protein extracts (20 μg)at the indicated time point (72 h)were analyzed by Western blotting using antibody against p-STAT3 and β -actin. ±s. n =3. △△P ＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs SAP group.圖5 各組p－STAT3 蛋白表達(dá)比較

Figure 6. The effect of QYD on the MCP -1 mRNA expression in pancreas of mice with acute pancreatitis. The total RNA in pancreas was abstracted and reversibly transcribed into cDNA. The cDNA was further analyzed by real-time PCR. ΔCt was used to calculate the level of MCP -1 mRNA. ±s.n =10. △△P ＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs SAP group.圖6 各組胰腺組織MCP－1 mRNA 表達(dá)變化

討 論

腹腔內(nèi)注射大劑量L -Arg 復(fù)制小鼠急性胰腺炎，是研究急性胰腺炎及防治措施較為理想的動物模型。我們曾給小鼠腹腔注射不同劑量(2 g/kg、3 g/kg、4 g/kg)的20% L -Arg，發(fā)現(xiàn)小鼠死亡率及造模的成功率與劑量明顯相關(guān)。采用20% L -Arg 以2 g/kg 的劑量給小鼠進(jìn)行腹腔注射，發(fā)現(xiàn)72 h 模型的成功率僅為60%，而4 g/kg 的劑量造膜后72 h 小鼠的死亡率超過了40%。因此我們選用了20% LArg 以3 g/kg 的劑量造模，72 h 后模型組動物可見胰腺腺泡細(xì)胞腫脹，及多處片狀壞死，間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤及出血;肺組織表現(xiàn)為肺泡間隔水腫、增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤;血漿淀粉酶活性、胰腺重量、肺組織勻漿MPO 水平明顯增加，提示腹腔內(nèi)注射大劑量L- Arg(3 g/kg)成功復(fù)制了小鼠急性胰腺炎模型。此法操作簡便，成本低，重復(fù)性好，病變的程度在不同胰腺部位比較一致，克服了其它模型需行剖腹術(shù)等缺點(diǎn)，再次證明L -Arg 腹腔注射是復(fù)制急性胰腺炎較為理想的方法［5］。

STAT3 是一種多功能的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛表達(dá)于多種類型的細(xì)胞和組織中，可被JAKs(Janus kinases)通過酪氨酸磷酸化激活成為p - STAT3，p -STAT3 表達(dá)水平是STAT3 活化程度的指征［7］。對結(jié)腸炎的信號通路研究發(fā)現(xiàn)［8］，過度生成的IL -6 首先與IL -6 受體結(jié)合，引發(fā)JAKs 磷酸化活化，繼而導(dǎo)致其下游的STAT3 磷酸化，磷酸化的STAT3(p -STAT3)分子形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核與特異的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)下游相關(guān)靶基因如炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。而采用caerulein 聯(lián)合脂多糖誘發(fā)的小鼠SAP 模型［9］也發(fā)現(xiàn):胰腺中STAT3 表達(dá)明顯增強(qiáng)，而IL-6 中和抗體可以抑制胰腺STAT3 的活化、減輕SAP 的損傷，提示胰腺STAT3 的活化可能與胰腺炎的病變程度存在著一定的因果關(guān)系。但是STAT3 在AP 發(fā)展中的作用尚不清楚。本課題采用20% L-Arg 復(fù)制小鼠急性胰腺炎模型，觀察SAP 模型胰腺STAT3 活化程度的變化，發(fā)現(xiàn)20% L - Arg注射后72 h，胰腺和肺組織可見明顯的病理損傷，胰腺p-STAT3 表達(dá)明顯增強(qiáng)，炎性細(xì)胞因子MCP -1 mRNA 表達(dá)增多，提示胰腺STAT3 活化可能參與SAP 的重癥化。由于在SAP 的動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中均發(fā)現(xiàn)MCP-1 上調(diào)，MCP-1 在急性胰腺炎的炎癥損傷尤其在急性胰腺炎并發(fā)肺損傷的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示STAT3 活化后進(jìn)入細(xì)胞核可能與特異性的DNA 序列結(jié)合，促進(jìn)其下游MCP－1 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

清胰湯是大承氣湯的加減方，其功效主要為通里攻下，活血化瘀，在臨床上已廣泛應(yīng)用于急性胰腺炎。研究發(fā)現(xiàn)，清胰湯除了能促使腸道功能恢復(fù)外，同時(shí)可以阻止炎癥介質(zhì)IL-6 的釋放［11］。清胰湯是否對IL-6 下游的STAT3 有抑制作用及其機(jī)制尚不清楚。我們采用清胰湯對L -精氨酸所誘發(fā)的SAP小鼠進(jìn)行治療發(fā)現(xiàn):清胰湯治療組p-STAT3 的表達(dá)明顯減少，提示清胰湯可以抑制胰腺STAT3 的活化。另外清胰湯治療組的胰腺重量、血清淀粉酶活性、MPO 水平明顯降低，胰腺、肺組織學(xué)損傷程度明顯減輕，胰腺M(fèi)CP-1 mRNA 的表達(dá)明顯減少，提示抑制STAT3 的活化可以減輕AP 的胰腺、肺的炎癥性損傷。本研究結(jié)果為SAP 的治療提供有價(jià)值的靶點(diǎn)，并為闡明清胰湯治療急性胰腺炎的作用和機(jī)制提供理論依據(jù)。

［1］ Mayer J，Rau B，Gansauge F，et al. Inflammatory mediators in human acute pancreatitis:clinical and pathophysiological implications［J］. Gut，2000，47(4):546 -552.

［2］ ?timac D，F(xiàn)i?i E，Mili S，et al. Prognostic values of IL-6，IL-8，and IL-10 in acute pancreatitis［J］. J Clin Gastroenterol，2006，40(3):209 -212.

［3］ 張曉云，汪東劍，余維濤.血清IL -6、IL -8 和TNF -α在重癥急性胰腺炎早期診斷中的臨床意義［J］.胰腺病學(xué)，2004，4(1):26 -28.

［4］ Atreya R ，Mudter J ，F(xiàn)inotto S ，et al . Blockade of interleukin 6 trans -signaling suppresses T -cell resistance against apoptosis in chronic intestinal inflammation:evidence in crohn disease and experimental colitis in vivo［J］. Nat Med，2000，6(5):583 -588.

［5］ 劉君君，陳 墾，龍友明，等. L -精氨酸誘導(dǎo)大鼠急性壞死性胰腺炎模型的建立［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(10):1392 -1394.

［6］ 林旭紅，李永渝. 急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制及相關(guān)治療的研究進(jìn)展［J］. 中國病理生理雜志，2010，26(5):1029-1032，1040.

［7］ 鐘敦璟，郭 紅，郝 嘉，等. STAT3 對大鼠重癥急性胰腺炎血清體外作用AT -II SP -C 的影響［J］. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30(19):1807 -1809.

［8］ Mitsuyama K，Sata M，Rose-John S. Interleukin-6 trans-signaling in inflammatory bowel disease［J］. Cytokine Growth Factor Rev，2006，17(6):451 -461.

［9］ Chao KC，Chao KF，Chuang CC，et al. Blockade of interleukin 6 accelerate acinar cell apoptosis and attenuates experimental acute pancreatitis in vivo［J］. Br J Surg，2006，93(3):332 -338.

［10］ Zhou GX，Zhu XJ，Ding XL，et al. Protective effects of MCP-1 inhibitor on a rat model of severe acute pancreatitis［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2010，9(2):201-207.

［11］ 聞慶平，陳海龍，關(guān)風(fēng)林.清胰湯對大鼠重癥急性胰腺炎時(shí)急性肺損傷治療作用的觀察［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2003，9(4):302 -306.