許立莉 李 淼 杜明偉 陳江帆 李建華

痰液肺癌細(xì)胞Ras基因和P63基因的表達與分子生物學(xué)意義

許立莉1李 淼2杜明偉1陳江帆1李建華＊

（1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科暨中國醫(yī)科大學(xué)病理教研室，沈陽110001；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，沈陽110034）

目的 研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞過程中Notch表達的研究。方法 別用免疫細(xì)胞化學(xué)方法和Western-blot方法檢測167例患者痰液中Ras基因和P63基因的表達情況，分析其對早期肺癌診斷的意義。結(jié)果 肺癌患者痰液中的Ras基因在痰脫落細(xì)胞中有明顯高表達，陽性率為75%。P63基因在肺癌痰細(xì)胞中陽性表達率為34.78%。結(jié)論利用Ras基因標(biāo)記物可以標(biāo)記出痰液中的肺非典型增生細(xì)胞和肺癌細(xì)胞，有利于肺癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷，并且可以作為肺癌的普查指標(biāo)或手段。

肺癌；Ras基因；P63基因；痰；液基

我國肺癌的發(fā)病率和死亡率一直呈上升和年輕化趨勢，早期診斷對于肺癌的治療和預(yù)后意義重大。目前，Ras基因突變引起腫瘤的關(guān)注度較高，作為一種癌基因在非惡性腫瘤細(xì)胞中處于抑制狀態(tài)，從而使細(xì)胞增殖處于一種動態(tài)平衡而維持其正常增殖狀況，當(dāng)其激活使得細(xì)胞動態(tài)平衡發(fā)生改變既可引起細(xì)胞惡變。

P63對肺鱗狀細(xì)胞癌的診斷及鑒別診斷有重要價值，尤其對于微小活檢標(biāo)本，聯(lián)合應(yīng)用可提高診斷正確率［1］。劉建等［2］研究發(fā)現(xiàn)，P63基因在肺鱗狀細(xì)胞癌與其他類型的癌之間表達差異是顯著的，可以作為鑒別肺鱗癌與其他類型癌的重要指標(biāo)。二者聯(lián)合使用應(yīng)可以判斷肺癌細(xì)胞起源，探索肺癌的發(fā)展趨勢及治療方案。

本研究是應(yīng)用免疫組化和 Western-blot方法，檢測痰液中難以明確診斷的肺非典型增生細(xì)胞以及肺癌細(xì)胞Ras基因表達變化或差異對比，探討能否提高早期肺癌細(xì)胞診斷率以及P63基因與Ras基因二者聯(lián)合應(yīng)用對肺癌分型的意義。

材料和方法

1.研究對象

收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2007年1月至2009年12月門診及病房患者痰液標(biāo)本5386例，除去細(xì)胞數(shù)較少或無，采集前6個月接受過治療及診斷不明的標(biāo)本，對痰液非典型增生細(xì)胞和癌細(xì)胞隨機提取，共147例，另外20例良性痰液標(biāo)本（診斷為炎性或結(jié)核）作為對照。男性患者116例，女性患者51例；年齡24-87歲，年齡小于等于40歲者23例，大于40歲者144例，全部病例經(jīng)臨床、CT、磁共振及細(xì)胞病理學(xué)診斷。

2.試劑

ras基因鼠抗人單克隆抗體，P63基因鼠抗人單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

3.切片的制備

收集的167例痰標(biāo)本采用液基細(xì)胞薄層方法（TCT）常規(guī)制片、診斷后，經(jīng)95%乙醇固定24h后石蠟包埋、切片。每份標(biāo)本切片分別用做HE染色、CK19、CKH、CK7、TTF-1目的確定肺源性上皮癌細(xì)胞以及Ras基因、P63基因免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

4.實驗方法

4.1 液基細(xì)胞薄層檢測技術(shù)（TCT）：

將痰液直接加入30ml清洗液和7-8滴消化液（1，4-二硫蘇糖醇）后振蕩約10min。離心，800轉(zhuǎn)／分，5min。棄上清液，將少許沉淀加入到盛有保存液的小瓶中，靜置10min后，用Thin Prep制成薄層細(xì)胞涂片，95%的酒精固定10min，巴氏染色。

4.2 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：采用液基細(xì)胞薄層方法（TCT）常規(guī)制片、診斷后，挑選細(xì)胞量多的陽性標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法（streptavidin-peroxidase，S-P）進行免疫細(xì)胞化學(xué)染色：切片常規(guī)烤片，脫蠟，水化；0.01mol／L檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)20min；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷溶液37℃下孵育30min；非免疫性動物血清37℃下孵育40min；一抗4℃下孵育過夜，Ras稀釋比例為1：50.生物素標(biāo)記的二抗37℃下孵育30min；鏈霉素親和素過氧化物酶溶液37℃下孵育30min；新配置的DAB溶液顯色；蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。各步之間用PBS（PH＝7.4）沖洗三次 ，每次5min。以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性肺癌切片作陽性對照。

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，每張切片在光鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)100個瘤細(xì)胞，著色強度分為無色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分。陽性細(xì)胞數(shù)分為＜10%為0分，10%-50%為1分，＞50%為2分，兩項得分相乘結(jié)果＞2記為陽性（＋），＜2為陰性。

4.3 Western-blot技術(shù) 總蛋白從痰脫落細(xì)胞中提取，冰上超生處理，4℃ 靜置，孵育50min，4℃ 離心20min（1000r／min），提取上清，用Brodford法測定蛋白濃度，以每孔80μg蛋白加入10%SDSPAGE凝膠電泳后，4℃ ，50V條件下濕電轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)入0.22μmPVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉2h，在分子量為18-25附近剪開PVDF膜孵育一抗（Ras 1：50稀釋）4℃過夜，ECL顯影，定影后拍照 。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用χ2檢驗（不滿條件時用Fisher確切概率法）分析各組計數(shù)資料，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Ras基因在肺癌患者痰中 Western-blot結(jié)果顯示

Ras基因在肺癌患者可見有特異性條帶，2號條帶為多次送檢標(biāo)本，痰液內(nèi)所含癌細(xì)胞量多，Ras基因的表達明顯增高，如圖1所示。

圖1 肺癌患者鎮(zhèn)南關(guān)Ras基因的表達Fig.1 Expression of Ras in patients of lung cancer

2.免疫組化結(jié)果

我們首先通過液基薄層細(xì)胞涂片（TCT）篩查，篩選出痰中可疑腫瘤細(xì)胞的標(biāo)本，對可疑病例做石蠟細(xì)胞包埋切片（HE），對于基本上可以確定為惡性的痰細(xì)胞標(biāo)本，進一步做免疫組化，TTF1和CK19二者石蠟包埋切片免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈強陽性表達，可以確定為肺癌痰腺癌細(xì)胞（如圖2所示）。

2.1 用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測167例患者痰液。

Ras基因在肺癌痰腺癌細(xì)胞細(xì)胞膜陽性表達。

P63基因在肺癌痰腺癌細(xì)胞細(xì)胞膜陽性表達，在肺癌痰鱗癌細(xì)胞細(xì)胞核陽性表達。

2.2 免疫組化Ras基因的表達與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系（表1）。

Ras基因在良性對照、非典型增生細(xì)胞、癌細(xì)胞的痰標(biāo)本內(nèi)的表達率分別為0%、75%、72.73%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01＊）。Ras基因在腺癌、混合型癌、鱗癌的痰標(biāo)本內(nèi)的表達率分別為74.6%、76%、75%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.25）。Ras基因在≤40歲患者陽性率為60.87%，＞40歲陽性患者表達率為65.97%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.5）。Ras基因男性患者的陽性率為68.10%，女性患者的陽性率為58.82%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.25）。

表1 Ras基因的表達與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Table 1 The relationship of expression of Ras gene with clinicopathological parameters

2.3 免疫組化P63基因的表達與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系（表2）。

P63基因在良性對照、非典型增生、癌細(xì)胞的痰標(biāo)本內(nèi)的表達率分別為0%、34.78%、18.18%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。P63基因在腺癌、混合型癌、鱗癌的痰標(biāo)本內(nèi)的表達率分別為38.1%、32%、50%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.1）。P63基因在小于等于40歲患者陽性率為60.87%，大于40歲患者陽性表達率為19.44%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.005）。P63基因男性患者的陽性率為24.14%，女性患者的陽性率為27.45%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.75）。

表2 P63基因的表達與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Table 2 The relationship of expression of P63gene with clinicopathological parameters

表3 Ras基因與P63基因聯(lián)合在肺癌痰細(xì)胞的表達Table 3The expression of Ras gene and P63 gene in lung cancer sputum cell

4.P63基因在大部分肺腺癌細(xì)胞內(nèi)呈細(xì)胞膜陽性表達

Ras基因在早期肺癌患者痰標(biāo)本內(nèi)既有高表達，對肺癌早期診斷具有重要意義，可以作為痰液基細(xì)胞肺癌診斷的標(biāo)記物，用于早期肺癌的診斷及防癌普查，本實驗中P63基因?qū)τ谠缙诜伟┰\斷的意義不顯著，有待于深入研究。

討 論

肺癌是目前全球頭號殺手，世界每年平均約有100萬人死于肺癌，肺癌以每年0.5%的速度增長，發(fā)病率占全部癌癥的11.3%，死亡率占全部癌癥的18%，而中國是世界上肺癌患者最多的國家，我國肺癌的發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢，每年增長率為4.7%，高于世界年平均增長水平近50倍。其中早期診斷的肺癌患者5年存活率可達到60-90%［3］，然目前我國肺癌的早診率僅為15%，肺癌患者約75%在就診時已處于晚期，盡管已有許多先進的治療方法，晚期肺癌患者5年生存率仍不到15%。更重要的是目前肺癌患者正在向年輕化發(fā)展，本組試驗中40歲以下患者占13.8%。不能對疑似肺癌的患者進行手術(shù)取組織標(biāo)本，多種早期肺癌診斷方法比較，自體熒光支氣管鏡（AFB）與白光支氣管鏡（WLB）聯(lián)合運用其敏感性為82.3%，特異性58.4%。痰液檢測的敏感度為65%，特異性可達到80%以上，因此痰液檢查是肺癌普查和早期診斷的最佳方法。

痰是肺癌早期診斷的病理標(biāo)本中取材最容易獲得的標(biāo)本，可以在肺癌發(fā)生的早期就獲得，而且痰標(biāo)本的取得安全無痛，可操作性強，最容易得到患者的配合。近年開展的液基薄層染色技術(shù)在制做痰涂片時消除了粘液等雜質(zhì)的影響，同時單層涂片消除了炎細(xì)胞的干擾，使背景清晰，細(xì)胞量大幅增加，是目前大力推廣的肺癌早期檢查方法。研究表明，痰細(xì)胞中出現(xiàn)的分子細(xì)胞學(xué)異常在對應(yīng)的腫瘤組織中均可檢測到，在郭秀娟等［4］的前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，具有痰細(xì)胞分子細(xì)胞學(xué)異常改變的非肺癌病人，一般均可能發(fā)展成為肺癌，這無疑為利用痰細(xì)胞進行肺癌分子診斷奠定了基礎(chǔ)。

ras基因是具有重要生理功能的編碼基因，家族成員包括大約50個相關(guān)的編碼基因GTP-binding參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中主要基因為H-ras、K-ras和N-ras。在大量相關(guān)研究中Ras基因是肺癌早期診斷的典型標(biāo)記物，在肺癌早期既有高表達，本試驗檢測出Ras基因在肺非典型增生細(xì)胞、癌細(xì)胞的痰標(biāo)本內(nèi)的表達率分別為75%、72.73%。Ras基因在非典型增生細(xì)胞內(nèi)的高表達，與譚敏等［10］研究結(jié)果相同，提示ras基因的突變是在肺癌的形成過程中即已發(fā)生，是肺癌發(fā)生的早期事件，圖片3：細(xì)胞學(xué)圖片初診時認(rèn)定為異型增生，后經(jīng)RAS基因細(xì)胞免疫化學(xué)證實為鱗癌細(xì)胞，組織病理學(xué)得已認(rèn)證。在肺癌高危人群的大量篩查及肺癌早期診斷中具有重要意義，通過篩查ras基因可以提高痰的肺癌早期檢出率。本實驗用 Western-blot方法檢測出惡性痰液內(nèi)Ras基因有高表達，結(jié)果顯示痰液內(nèi)所含肺癌細(xì)胞越多，則Ras基因的表達越強（圖1）。本組免疫組化結(jié)果證實Ras基因在肺癌患者的表達與年齡、性別、細(xì)胞分化程度無顯著關(guān)系，沒有統(tǒng)計學(xué)意義P＞0.05（表1），這與陳萍等［11］的研究結(jié)果相同。Ras基因突變率在腺癌中最高，分別于鱗癌和小細(xì)胞癌之間存在顯著性差異（P＜0.05），在鱗癌與小細(xì)胞癌之間無顯著差異［12■。本組實驗Ras基因在肺腺癌、鱗癌、混合型癌無顯著關(guān)系，沒有統(tǒng)計學(xué)意義P＞0.05（表1），可能與本組實驗鱗癌例數(shù)過少有關(guān)。

P63基因是P53家族的新成員，其表達直接或間接影響細(xì)胞的增殖活性［5］。P63基因的生物學(xué)功能體現(xiàn)在指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控、參與細(xì)胞調(diào)控及凋亡、在表皮發(fā)育中起作用、與衰老及腫瘤發(fā)生的關(guān)系等方面［6］。本組實驗顯示，P63基因在年齡大于40歲肺癌患者的陽性率低于小于40歲的陽性率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），此結(jié)果提示P63基因表達增殖細(xì)胞，隨著細(xì)胞的衰老P63表達減弱（表2）。P63基因在肺癌痰細(xì)胞中的表達與性別和病理分型無顯著關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，P63在原發(fā)性肺癌主要表達與鱗狀細(xì)胞癌的癌細(xì)胞中，在肺鱗癌中陽性表達率均高于90%［7-9］。然P63基因在本組4例鱗癌中僅有2例陽性表達，可能與本組鱗癌例數(shù)過少有關(guān)系。

目前，早期肺癌痰的陽性檢出率應(yīng)可達到60%-80%，但痰的實際陽性檢出率僅為8%-19.6%。中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院近3年痰瘤細(xì)胞的陽性檢出率分別為：2007年30.20%、2008年22.28%、2009年20.07%。陽性檢出率較低，并不代表陽性率低，很多增生伴有癌變，肺癌早期的癥狀輕，就診的患者少，且分化高的腫瘤細(xì)胞不易與增生區(qū)別，造成很多細(xì)胞學(xué)醫(yī)生對于早期肺癌的細(xì)胞形態(tài)認(rèn)識不清，認(rèn)識的都是中晚期。因此，應(yīng)側(cè)重早期肺癌的診斷，找到高效率的特異性指標(biāo)，進行分子生物學(xué)篩查，以提高癌前病變的診斷率為發(fā)展方向。

肺癌的治療方法越來越先進，根據(jù)治療的需要尋找早期肺癌的診斷方法是肺癌早期診斷的另一個發(fā)展方向。用痰液分析與肺癌相關(guān)的microRNA才剛剛起步，尋找痰液中與肺癌相關(guān)的microRNA分子將會給肺癌的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療及合理治療創(chuàng)造新的機會。Ras基因作為一種癌基因在非惡性腫瘤細(xì)胞中處于抑制狀態(tài)，當(dāng)其激活使得細(xì)胞動態(tài)平衡發(fā)生改變既可引起細(xì)胞惡變。耶魯大學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)mrioRNA通過與Ras信息結(jié)合來調(diào)節(jié)Ras，并可能抑制Ras蛋白的翻譯。MicroRNA不能將突變的Ras基因變回正常，但它能充當(dāng)一個被"加速"的Ras的"剎車"。由此可見，Ras基因不僅在肺癌早期診斷有重要意義，對肺癌的的治療提供了更新更有效的方法。

P63在本組實驗內(nèi)陽性率低于Ras基因，且其在腺癌中多為細(xì)胞膜陽性表達，組織標(biāo)本亦有相同表達（圖4）。目前純鱗癌已經(jīng)少見，P63基因與Ras基因二者均呈陽性多為混合型癌。

以上研究表明Ras基因不僅對肺癌早期診斷具有重要意義，可以用作早期肺癌篩查標(biāo)記物，對于肺癌的治療也有重要作用。肺鱗癌患者在臨床檢出前3年即可出現(xiàn)分子生物學(xué)異?，F(xiàn)象，P63基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在上皮性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有的雙向作用，對于腫瘤的預(yù)防和治療有重大意義，而且P63基因是鱗狀上皮增殖的特異性標(biāo)記，其對于早期肺癌診斷的意義有待于深入研究。

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圖 版 說 明

圖2 A：肺癌痰腺癌細(xì)胞液基薄層涂片（TCT）×600；B：肺癌痰腺癌細(xì)胞石蠟包埋切片（HE）×600；C：免疫細(xì)胞化學(xué)染色，CK19在肺癌痰腺癌細(xì)胞中陽性表達 ×600；D：免疫細(xì)胞化學(xué)染色，TTF-1肺癌痰腺癌細(xì)胞陽性表達×600

圖3 E：免疫細(xì)胞化學(xué)染色，Ras基因在肺癌痰腺癌細(xì)胞陽性表達 ×600；F：免疫細(xì)胞化學(xué)染色，P63基因在肺癌痰腺癌細(xì)胞陽性表達×600；G：免疫細(xì)胞化學(xué)染色，Ras基因在肺癌痰鱗癌細(xì)胞中陽性表達 ×400；H：免疫細(xì)胞化學(xué)染色，P63基因在肺癌痰鱗癌細(xì)胞陽性表達×600

圖4 I：P63在肺癌痰腺癌細(xì)胞細(xì)胞膜陽性表達×400；J：P63在肺腺癌組織細(xì)胞膜陽性表達×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.2 A：Adenocarcinoma cell of sputum（TCT）×600；B：Adenocarcinoma cell of sputum（HE）×600 ；C：IHC-Strong membrane staining of CK19in adenocarcinoma cells from sputum×600；D：IHC-Strong nucleus staining of TTF-1in adenocarcinoma cells from sputum×600

Fig.3 E：IHC-Strong membrane staining of Ras in adenocarcinoma cells from sputum ×600；F：IHC-Strong nucleus staining of P63in adenocarcinoma cells from sputum ×600；G：IHC-Strong membrane staining of Ras gene in squamous cell carcinoma cells from sputum ×200；H：IHC-Strong nucleus staining of P63，gene in squamous cell carcinoma cells from sputum ×600

Fig.4 I：IHC-Strong membrane staining of P63in adenocarcinoma cells from sputum ×600；J：IHC-Strong membrane staining of P63in adenocarcinoma cells from tissue×200

Molecular biological observation and study of lung cancer cells from sputum

Xu Lili1，Limiao2，Du Mingwei1，Chen JiangFan1，Li Jianhua＊
（1Department of Pathology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang110001，China ；2Department of Pathology，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine；Shenyang110034，China）

Objective To investigate the value of the Ras gene in sputum cells in the diagnosis of lung cancer，and the diagnostic value of combination detection of Ras and P63genes in lung cancer.Methods The expression of Ras and P63genes in sputum was detected by immuncytochemistry and Western-blot method，and its meaning for the early diagnosis of lung cancer was analyzed.Results 75%lung cancer cells showed Ras gene mutation，much higher than in normal cells（P＜0.05）.34.78%lung cancer cells showed P63gene mutation，also higher than in normal sputum cell（P＜0.05）.Conclusion The Ras gene can be used to label suspicious and early cancerous cells in the sputums for the early diagnosis of lung cancer.

Lung cancer；Ras genes；P63genes；Sputum；Thin prep

R349.5

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.017

2011-06-14

2011-09-15

國家自然科學(xué)基金（30801131）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（200804861045）

許立莉，女（1977年），漢族，主治醫(yī)師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）