邢玲玲 段惠軍 劉青娟 傅淑霞 劉淑霞 郝 軍

PI3K／Akt通路在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原中的作用

邢玲玲1，2段惠軍1＊劉青娟1傅淑霞2劉淑霞1郝 軍1

（1河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室，石家莊050017；2河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科，石家莊050000）

目的 探討磷酸酰肌醇3激酶／蛋白激酶B（PI3K／Akt）信號通路在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原（ColⅣ）中的作用。方法 體外培養(yǎng)小鼠腎足細(xì)胞，給予高糖刺激（30mmol／L）處理0h、12h、24h、48h，正常糖（5mmol／L）分別培養(yǎng)相同時間作為對照，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法和蛋白印跡法檢測p-Akt、ColⅣ的表達(dá)。結(jié)果 高糖可以誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白表達(dá)，隨刺激時間延長分泌增多，24h達(dá)到高峰，各時間點相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；足細(xì)胞內(nèi)ColⅣ蛋白表達(dá)隨高糖刺激時間延長逐漸增多，并與p-Akt表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.834，P＝0.001）。結(jié)論 高糖可能通過激活PI3K／Akt通路誘導(dǎo)足細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原。

PI3K／Akt通路；足細(xì)胞；Ⅳ型膠原

隨著人民生活水平的提高和人口老齡化的不斷加速，糖尿病腎病 （diabetic nephropathy，DN）發(fā)病率逐年提高，其發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明。腎小球的三種固有細(xì)胞均與DN的發(fā)生有著密切關(guān)系，但最近研究認(rèn)為足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致腎小球硬化的關(guān)鍵因素［1］。隨著生化技術(shù)的發(fā)展及足細(xì)胞系的建立，對足細(xì)胞的研究和認(rèn)識也逐漸深入。體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，高糖刺激足細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原（collogenⅣ，ColⅣ）、血管內(nèi)皮生長因子等表達(dá)，導(dǎo)致基底膜變厚，表明足細(xì)胞損傷參與了糖尿病腎小球硬化發(fā)生［2］。

磷酸酰肌醇3激酶／蛋白激酶 B（phosphoinositide 3kinese／protein kinase B，PI3K／Akt）信號通路參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡以及遷移等，其過度激活導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào)。新近研究表明，PI3K／Akt信號通路參與高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，提示該通路在腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用［3］。該途徑在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷方面的研究未見報道。本課題擬通過體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞，觀察PI3K／Akt通路以及Ⅳ型膠原在足細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化，探討PI3K／Akt通路在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原中的作用。

材料和方法

1.材料

小鼠腎足細(xì)胞株從中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心購買。兔抗p-Akt多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，兔抗ColⅣ多克隆抗體購自北京博奧森公司，SABC步法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。

2.方法

2.1 建立高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞模型

小鼠足細(xì)胞按 Mundel等［4］方法進(jìn)行培養(yǎng)：將凍存的足細(xì)胞復(fù)蘇后置于含10U／mlγ-干擾素的10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液中，在33℃細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中培養(yǎng)傳代，然后轉(zhuǎn)入不含γ-干擾素的10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)孵箱中使足細(xì)胞分化10-14d后，給予高糖（high glucose，HG，30mmol／L）刺激，分別培養(yǎng)0、12、24、48h，同時以正常糖（normal glucose，NG，5mmol／L）培養(yǎng)相同時間作為對照，收集不同時間點足細(xì)胞。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測

采用6孔板，置無菌蓋玻片爬片，每組6孔細(xì)胞，70%乙醇固定細(xì)胞30min；3%H2O2甲醇室溫孵育10min；羊血清封閉37℃孵育30min；一抗（兔抗p-Akt抗體1∶100稀釋，兔抗ColⅣ抗體1∶50稀釋）4℃過夜，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對照；二抗37℃孵育30min；三抗37℃孵育25min；以上每步之間應(yīng)用PBS緩沖液沖洗，5min，3次；DAB顯色。光鏡下觀察足細(xì)胞內(nèi)p-AKT、ColⅣ的表達(dá)。

2.3 Western blot分析

在不同時間點收集的細(xì)胞中，加入300μl蛋白裂解液裂解細(xì)胞，低溫離心機(jī)離心，12000rpm，20min后提取蛋白上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，-80℃保存。每個樣品取50μg總蛋白，10%SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉37℃封閉2h，再分別加入抗p-Akt抗體（1∶1000稀釋）和抗ColⅣ抗體（1∶500稀釋），4℃過夜。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。以β-actin（1∶1000稀釋）作為內(nèi)參照。Western blot條帶信號強(qiáng)度應(yīng)用LabWork 45圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，測定各條帶的吸光度值（IOD）。以上實驗過程重復(fù)3次。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包分析，實驗數(shù)值用表示，多組之間比較采用方差分析進(jìn)行顯著性檢驗，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測p-Akt、ColⅣ的表達(dá)

正常糖組足細(xì)胞內(nèi)未檢測到p-Akt表達(dá)，高糖組足細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)和胞漿中均有P-Akt表達(dá)，24h明顯（圖1A和1B）。ColⅣ在正常糖組未檢測到表達(dá)，高糖組主要表達(dá)在足細(xì)胞胞漿中，時間上與PAkt表達(dá)一致，24h表達(dá)最明顯（圖2A和2B）。

2.Western blot檢測足細(xì)胞內(nèi)p-Akt、ColⅣ蛋白水平

Western blot檢測p-Akt、ColⅣ的表達(dá)與免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果基本一致（圖3）。通過圖像分析軟件進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，高糖刺激足細(xì)胞12h后，p-Akt表達(dá)增多，24h達(dá)到高峰，48h后逐漸下降，各時間點相比均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）。ColⅣ表達(dá)隨高糖刺激時間延長表達(dá)增多，24h最高，各時間點比較也均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）（表1）。足細(xì)胞內(nèi)p-Akt與ColⅣ表達(dá)具有明顯的正相關(guān)關(guān)系（r＝0.834，P＝0.001）。

表1 定量分析足細(xì)胞內(nèi)p-Akt、ColⅣ蛋白的水平（ˉx±s，n＝3）Table 1 The quantitative analysis of the level of p-Akt，ColⅣprotein in podocytes （ˉx±s，n＝3）

圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察足細(xì)胞內(nèi)p-Akt的表達(dá) （×400）A：正常糖刺激足細(xì)胞24hB：高糖刺激足細(xì)胞24h圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察足細(xì)胞內(nèi)ColⅣ的表達(dá) （×400）A：正常糖刺激足細(xì)胞24hB：高糖刺激足細(xì)胞24hFig.1 Immunocytochemistry staining for observating the expression of p-Akt in podocytes（×400）A：podocytes treated by nomal glucose for 24h；B：podocytes treated by high glucose for 24hFig.2 Immunocytochemistry staining for observating the expression of ColⅣin podocytes（×400）A：podocytes treated by nomal glucose for 24h；B：podocytes treated by high glucose for 24h

圖3 Western blot檢測正常糖和高糖刺激足細(xì)胞后不同時間p-Akt、ColⅣ蛋白的表達(dá)。A：正常糖組；B：高糖組Fig.3 Western blot analysis of the expression of p-Akt，ColⅣin podocytes cultured by nomal glucose and high glucose for different time.A：NG group；B：HG group

討 論

DN是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致慢性腎衰竭的重要原因，臨床上以持續(xù)性蛋白尿和進(jìn)行性腎功能減退為特征，基本病理改變是基底膜（glomerular basement membrane，GBM）增厚、細(xì)胞外基質(zhì)積聚和結(jié)節(jié)性腎小球硬化。其中細(xì)胞外基質(zhì)積聚是DN的關(guān)鍵性改變。近年來國內(nèi)外學(xué)者研究認(rèn)為足細(xì)胞損傷在DN的發(fā)展中具有重要作用，但是足細(xì)胞損傷機(jī)制尚不清楚。研究表明，高糖環(huán)境、血液動力學(xué)改變、血管緊張素Ⅱ、細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β1等均可導(dǎo)致足細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原增多，促進(jìn)GBM增厚［5-6］。本實驗結(jié)果提示，高糖刺激可引起足細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原，與國外Ha和Hong的報道一致［7］；隨刺激時間延長，足細(xì)胞內(nèi)Ⅳ型膠原表達(dá)增多，高峰在24小時，48小時后表達(dá)開始減弱，這種表達(dá)的時間規(guī)律性與Akt的激活一致。

PI3K／Akt通路的發(fā)現(xiàn)已有十幾年的歷史，其激活是一個多步驟的過程：受體酪氨酸激酶與其配體結(jié)合發(fā)生磷酸化后激活PI3K，PI3K活化后磷酸化磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇三磷酸 （phosphatidylinositol 3，4，5 2trisphosphate，PIP3），PIP3和Akt N端的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上進(jìn)一步被磷酸化，并作用于一系列底物，發(fā)揮其生物學(xué)作用。本實驗通過體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，高糖可刺激足細(xì)胞內(nèi)Akt的激活，使p-Akt表達(dá)隨時間延長而增多，且與Ⅳ型膠原的分泌高峰一致，二者表達(dá)具有正相關(guān)關(guān)系，提示高糖可能通過PI3K／Akt通路增強(qiáng)了足細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原。Li等［8］也在系膜細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)，高糖引起系膜細(xì)胞內(nèi)Ⅳ型膠原的表達(dá)是通過激活A(yù)kt和轉(zhuǎn)化生長因子-β實現(xiàn)的。

本研究通過體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，高糖可以誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)p-Akt的表達(dá)，伴有Ⅳ型膠原的分泌增多，二者表達(dá)具有一定的相關(guān)性，提示高糖可能通過激活PI3K／Akt信號通路，上調(diào)足細(xì)胞內(nèi)Ⅳ型膠原的表達(dá)，導(dǎo)致GBM增厚，進(jìn)一步提示PI3K／Akt信號通路可能介導(dǎo)了足細(xì)胞損傷，參與了糖尿病腎病的發(fā)展。足細(xì)胞損傷的機(jī)制是多因素、多途徑的共同作用，是各種致病因子間相互作用的結(jié)果，并非單一因素或單一途徑發(fā)揮作用。這些致病因子間的相互作用以及信號途徑間的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制還需進(jìn)一步深入的研究。隨著體外足細(xì)胞研究的發(fā)展，PI3K／Akt信號通路為了解足細(xì)胞損傷的機(jī)制及防治手段提供了一條新的途徑。

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Effect of PI3K／Akt pathway on the expression of collagenⅣin mouse podocytes induced by High Glucose

Xing Lingling1，2，Duan Huijun1＊，Liu Qingjuan1，F(xiàn)u Shuxia2，Liu Shuxia1，Hao Jun1
（1Department of Pathology，Hebei Medical University，Shijiazhuang050017；2Department of Nephrology，the Second Affiliated Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050000，China）

Objective To investigate the effect of the phosphoinositide 3kinese／protein kinase B（PI3K／Akt）pathway on the expression of collagen Ⅳ（ColⅣ）in mouse podocytes induced by high glucose.Methods Cultured mouse podocytes were divided into the high glucose（30mmol／L，HG）group and the normal glucose（5mmol／L，NG）group.Cells were collected respectively at 0，12，24，48hafter stimulation.The expression of phospho-Akt and collogenⅣ were detected by immunocytochemistry and Western blot.Results Compared with that of the NG group，the expression level of phospho-Akt was increased in a time-dependent manner，and reached the peak at 24h.The expression level of ColⅣin mouse podocytes was increased gradually with prolongation of stimulus.There was an obvious positive correlation between the level of ColⅣand that of phospho-Akt（r＝0.834，P＝0.001）.Conclusion High glucose may induce the expression of ColⅣin mouse podocytes by activating the PI3K／Akt pathway.

PI3K／Akt pathway；Podocyte；CollagenⅣ

R735.2

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.004

2011-05-25

2011-09-20

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題（20090055）

邢玲玲，女（1978年），漢族，主治醫(yī)師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）