李文媛 王 瑩 孫 平 賈 樺 佟曉杰

骨髓間充質干細胞移植對大鼠腦缺血再灌注損傷Livin和Caspase-3表達的影響

李文媛1＊王 瑩1孫 平1賈 樺2佟曉杰2

（1牡丹江醫(yī)學院解剖教研室，黑龍江157011；2中國醫(yī)科大學解剖教研室，沈陽110001）

目的 探討骨髓間充質干細胞（BMSCs）移植對大鼠腦缺血再灌注損傷海馬區(qū)凋亡相關基因Livin和Caspase-3表達及神經元細胞凋亡的影響。方法 實驗動物分為假手術組、模型組和BMSCs組，進行神經功能評分，應用TTC法檢測腦梗死體積，追蹤PKH26標記的移植BMSCs，應用免疫組化方法和 Western blot檢測Livin、Caspase-3蛋白表達，應用TUNEL法檢測細胞凋亡。結果 PKH26標記的BMSCs在海馬區(qū)有表達。與模型組比較，BMSCs組神經功能評分顯著降低（P＜0.05），腦梗死體積顯著減少（P＜0.05）。BMSCs組與模型組相比Livin蛋白表達顯著增高（P＜0.05），Caspase-3蛋白表達明顯下降（P＜0.05），神經元細胞凋亡指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。結論 BMSCs對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其作用機制可能與上調Livin表達，下調Caspase-3表達，抑制細胞凋亡有關。

骨髓間充質干細胞；腦缺血再灌注；Livin；Caspase-3

腦缺血后恢復腦血流是治療腦缺血最關鍵的方法，但再灌注后可加重缺血腦組織的損傷，這種損傷以凋亡為主，因此減少缺血／再灌注后神經元凋亡為重要的腦保護機制。Livin作為一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白（IAP）能夠干預細胞凋亡線粒體通路，發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用［1］。Caspase-3是凋亡過程中最關鍵的蛋白酶，是多種死亡受體介導的凋亡途徑的共同下游效應部分［2］。為了探討骨髓間充質干細胞（BMSCs）抑制腦缺血再灌注損傷神經元凋亡的機理，本實驗觀察了腦缺血再灌注損傷后BMSCs移植對海馬區(qū)神經元細胞凋亡、Livin和Caspase-3蛋白表達的影響，為BMSCs移植治療神經系統(tǒng)疾病的臨床應用提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1.動物、藥品及試劑

雄性SD大鼠42只，清潔級，體重280-320g，購于中國醫(yī)科大學實驗動物中心（許可證號：SYXK［遼］2003-0013），兔抗大鼠 Livin抗體、兔抗大鼠Caspase-3抗體、免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒、TUNEL試劑盒購于北京中山生物試劑公司，PKH26試劑盒購于sigma公司，抗β-actin抗體購于Santa Cruz公司。

2.BMSCs培養(yǎng)與鑒定

體質量100-120g健康雄性SD大鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下取雙側脛骨和股骨，用DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集骨髓沖洗液，平均分裝在2個50ml培養(yǎng)瓶中，每瓶加至培養(yǎng)基5ml，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待貼壁細胞完全融合后，2.5g／L胰酶消化傳代。當細胞傳至第三代時接種到兩個瘤孔板內，每孔細胞密度為1x105個／ml，達到80%共融時每個板分別加入成骨誘導劑，進行BMSCs向成骨誘導的細胞鑒定。成骨誘導劑為：含有10% 小牛血清的DMEM，0.1μmol／L的地塞米松，50μ的維生素C，10mmol／L的β-磷酸甘油鈉；成脂肪誘導劑為：含有10% 小牛血清的DMEM，0.5mmol／L3-異丁 基-1-甲 基 黃 嘌 呤，1μmol／L 的 地 塞 米 松，10μmol／L的胰島素，200μmol／L的吲哚美辛。

胰酶和／或EDTA消化BMSCs形成單細胞懸液。2×107細胞于錐形離心管中，用無血清培養(yǎng)基洗一次；離心5min；吸去上清，加1ml稀釋液C，重懸細胞保證完全離散，別震蕩。染色前，準備4×106mol／L的PKH26染液（用稀釋液C稀釋）置于離心管中。盡快加1ml 2×細胞到1ml 2×染料，立即用吸管均勻快速混合樣品，25℃孵育的2-5min，定時輕輕顛倒離心管保證在25℃充分混勻。加入等量血清或1%BSA中止染色反應，孵育1min。用等量含血清培養(yǎng)基稀釋中止的反應液。400g、25℃離心10min，去上清。細胞團轉入新試管中，進一步洗三次。加10ml完全培養(yǎng)基，離心，重新懸置細胞。

4.模型制備及動物分組

參照Longa等［3］的線栓改良法制成大鼠右側大腦中動脈缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，將大鼠采用隨機數(shù)字表法分為：假手術組（n＝12）、模型組（n＝12）和BMSCs組（n＝12），模型組和BMSCs組分別于建模成功后3h經尾靜脈注射等體積的PBS液和已制備好的BMSCs懸液，BMSCs組每只大鼠移植細胞數(shù)為4×106個／100μl。

5.神經功能評估

采用Chen等［4］報道的神經功能損害評分表（neurological severity scores，NSS），從運動、感覺、反射、平衡4方面進行神經功能損害評估，22分為最嚴重的神經功能損害，即評分越高神經功能損害越嚴重。缺血后7d各組大鼠分別進行NSS評分。

6.TTC法染色

取部分腦組織冠狀面均勻切成2mm厚腦片，2%TTC染色，數(shù)碼相機拍照，以圖像處理軟件（image Pro Plus 5.1，Olympus）測量梗死面積，計算梗死面積與損傷側腦半球的面積比。

③開發(fā)商與農戶結合的小農市場風險盛行階段。開發(fā)商充分借助多種基層運作的方式獲得了土地使用權，村集體沒有實權，因此開發(fā)商能夠不通過村集體而通過村代理人與農戶開展村集體土地經營權交易活動，這一過程中存在著非常明顯的市場風險與農業(yè)風險。若在這一過程中市場主體數(shù)量明顯增多，則村莊發(fā)展過程中無法形成規(guī)范化的秩序，進而對村莊的健康發(fā)展產生了十分不利的影響。

7.免疫組織化學檢測

缺血后7d，取腦組織行冰凍切片，在視交叉后1-4mm處冠狀切面切開，在海馬齒狀平面連續(xù)冠狀切片，片厚4μm。組織薄片以PBS漂洗2次，0.5%過氧化氫孵育10min；PBS漂洗3次，正常山羊血清37℃孵育15min后，滴加稀釋后的一抗Livin（1：100）、Caspase-3（1：150），4℃過夜。滴加生物素標記體，30min，37℃。滴加過氧化物-鏈霉素卵白素37℃，30min。DAB顯色液顯色。蘇木精復染，以PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片。陽性率的定量分析：每個標本取4張切片，400倍光鏡下每張切片在海馬隨機選5個視野，用計算機圖像分析系統(tǒng)（HPIAS-1000）對各組陽性細胞進行OD值分析。

8.凋亡神經元的檢測

缺血后7d，采用原位末端TUNEL標記法檢測。將甲醛固定大鼠海馬組織標本常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚4μm，脫蠟后按照In situApoptosis Detection Kit說明書操作；陰性對照采用pH7.2-7.6，0.01mol／L PBS代 替 TUNEL 反 應液。陽性率的定量分析：每個標本取4張切片，每張切片在海馬隨機選5個視野，400倍光鏡下應用目鏡陽性細胞所占的百分比。細胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）＝凋亡陽性細胞總數(shù)／細胞總數(shù)。

9.Western blot法

缺血后7d，檢測Livin和Caspase-3表達提取蛋白后采用BCA定量試劑盒測定蛋白濃度。SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白后轉至硝酸纖維素膜；封閉緩沖液封閉后，加入一抗（anti-Livin 1：100稀釋，anti-Caspase-3 1：120稀釋）4℃孵育過夜，各自對應二抗（1∶2000稀釋）孵育2h，TBS洗凈后經顯色液顯示15min，掃描后經Image J圖像分析軟件對印跡區(qū)進行灰度分析。

10.統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)以采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均值±標準差（ˉx±s）表示，采用不配對t檢驗及單因素方差分析處理數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異有顯著性。

結 果

1.BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定

相差顯微鏡下觀察，剛接種時為懸浮于培養(yǎng)液中的大小不等圓形細胞，48h后可見少數(shù)細胞貼壁，為成纖維細胞樣細胞，圓形細胞附著在這成纖維細胞樣細胞表面。以后貼壁成纖維細胞樣細胞逐漸增多，圓形細胞經反復傳代后消失，約在7-10d80%-90%長滿培養(yǎng)瓶底，融合成單層，此時傳代。傳3代后的BMSCs形態(tài)更加均一，排列更加有序，呈漩渦狀排列，3-4d左右即可長滿培養(yǎng)瓶底，純度達到95%以上（圖1A），約7d左右貼壁率達80%-90%。應用成骨細胞誘導液配制培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs，2-3d換一次培養(yǎng)液，28d后發(fā)現(xiàn)細胞胞漿出現(xiàn)鈣鹽沉積，茜素紅染色后胞漿內呈紅色聚集物（圖1B）

圖1 A：第3代，細胞呈漩渦樣排列（×200）。B：體外誘導28d，細胞內的鈣沉積茜素紅染色（×400）。C：海馬內PKH-26標記紅色熒光BMSCs（×100）。Fig.1 A：BMSCs within 3passages were exhibited whirlpool morphology in the confluent culture（×200）；B：After differentiation 28d，the deposition of calcium was determined by Alizarin Red（×400）；C：Red PKH-26Labeled BMSCs were observed in hippocampus（×100）.

2.BMSCs移植對神經功能損害評分的影響

假手術組神經功能損害評分值為0，無神經功能損害。BMSCs組（11.92±1.69）神經功能損害評分低于模型組（14.82±1.52），差異有顯著性（P＜0.05）。

3.BMSCs移植對腦梗死體積檢測的影響

TTC染色檢測缺血后大鼠腦梗死體積，假手術組腦梗死體積為0，模型組和BMSCs組在缺血后1d和3d腦梗死體積無顯著差異（P＞0.05），缺血后7dBMSCs組腦梗死體積顯著低于模型組，差異有顯著性（P＜0.05）（圖2）。

圖2 TTC染色檢測各組腦梗死體積比，＊與模型組比較P＜0.05，n＝6。Fig.2 Infarct volumes by TTC staining and expressed as percnetage infarct volume determined by comparison with the contralateral hemisphere，＊vs model group，P＜0.05，n＝6.

圖3 A：海馬區(qū)Livin陽性表達（×400）。B：海馬區(qū)Caspase-3陽性表達（×400）。D：海馬區(qū)凋亡細胞（×400）。Fig3Immunohistochemical stain of Livin（A）and caspase-3（B）in hippocampus（×400）.D：Nuclei of apoptotic cells in hippocampus（×400）.

4.PKH-26標記的BMSCs在腦組織中的分布

缺血后7d，冰凍切片免疫熒光追蹤PKH-26標記的移植BMSCs，可見BMSCs組在海馬區(qū)有紅色熒光信號表達（圖1C）。而假手術組、模型組沒有發(fā)現(xiàn)紅色熒光信號。

5.BMSCs移植對 Livin、Caspase-3及細胞凋亡的影響

Livin和Caspase-3陽性細胞胞質著色，呈棕黃色（圖3A，B）。缺血后7d，假手術組未見Caspase-3蛋白表達，Livin蛋白有少量表達。模型組Livin蛋白表達與假手術組無差異（P＞0.05），但Caspase-3蛋白表達顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，BMSCs組Caspase-3蛋白表達明顯降低，Livin蛋白表達增高，差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。假手術組腦組織未見神經元細胞凋亡。模型組和BMSCs組可見到海馬區(qū)神經元細胞凋亡，凋亡細胞胞質呈棕褐色（圖3C）。BMSCs組神經元細胞凋亡指數(shù)明顯少于模型組，差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 海馬區(qū)Livin、Caspase-3蛋白平均光密度值及神經元細胞凋亡指數(shù) （OD，ˉx±s，n＝6）Table 1 Apoptosis index of neurocytes，average optical desity of Livin and Caspase-3in hippocampus （OD，ˉx±s，n＝6）

6.Western blot的檢測結果

缺血后7d，Western blot檢測模型組和假手術組未見Livin蛋白表達（P＞0.05），模型組Caspase-3蛋白相對表達較假手術組顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，BMSCs組Caspase-3蛋白相對表達明顯下降，Livin蛋白相對表達顯著增高（P＜0.05）（圖4A，B）。

圖4 A：Western blot檢測各組Livin和Caspase-3蛋白表達。B：各組Livin和Caspase-3蛋白相對表達，＊與假手術組比較P＜0.05，＊＊與模型組比較P＜0.05；n＝6。Fig.4 （A）Western blot results of Livin and Caspase-3in groups.（B）Protein relative intensity of Livin and Caspase-3in groups，＊vs sham operation group P＜0.05，＊＊vs model group P＜0.05，n＝6.

討 論

骨髓間充質干細胞作為成體干細胞的一種，具有多向分化、增殖迅速、長期存活和低免疫原性的特點，可用于神經損傷時組織工程化的種子細胞［5］。有研究表明BMSCs能局部和靜脈注射移植治療中樞神經系統(tǒng)損傷［6］。本實驗用PKH26標記的BM-SCs靜脈途徑移植給腦缺血大鼠，可見海馬區(qū)有大量存活的PKH-26標記的BMSCs，證實了靜脈移植的BMSCs能夠通過血腦屏障進入宿主腦內，遷移至海馬區(qū)發(fā)揮作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)在缺血后7d，BMSCs組神經功能恢復明顯優(yōu)于模型組，梗死體積也顯著減少，說明BMSCs移植具有抑制細胞凋亡和神經保護的作用。

細胞凋亡線粒體通路在缺血性腦損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其作用途徑是指氧自由基、鈣超載等凋亡刺激因素使線粒體通透性增加，線粒體跨膜電位下降，釋放細胞色素C（CytoC），CytoC主要激活Caspase-9進而也激活下游的Caspase-3，誘導細胞凋亡［7］。Livin作為一個新的凋亡抑制蛋白能夠作用于線粒體通路，可以直接與Caspase-9前體蛋白（proCaspase-9）和其激活形式結合從而抑制其活性，還可以直接結合并抑制Caspase-3的活性，阻斷他們依次裂解激活，同時阻斷了Caspase-3對pro-Caspase-9的反饋激活，抑制細胞的調亡［8-9］。所以Livin基因的主要作用是抑制細胞凋亡和延長細胞壽命，而Caspase-3基因作用卻相反，起著加速細胞死亡的作用。本研究發(fā)現(xiàn)與模型組相比，BMSCs移植能明顯上調Livin蛋白表達，下調Caspase-3蛋白表達，降低神經細胞凋亡指數(shù)。提示BMSCs可能通過增加Livin表達，抑制促細胞凋亡基因Caspase-3表達，從而減少腦缺血再灌注損傷神經元細胞凋亡的發(fā)生，改善腦缺血大鼠的神經功能。

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Effects of bone mesenchymal stem cell transplantation on expressions of Livin and caspase-9after cerebral Ischemia-reperfusion in rats

Li Wenyuan1，Wang Ying1，Sun Ping1，Jia Hua2，Tong Xiaojie2
（1Department of Anatomy，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang157011；2Department of Anatomy，China Medical University，Shenyang110001，China）

Objective To investigate the effects of transplantation of bone mesenchymal stem cells on the apoptosis of neural cells and the expressions of Livin and Caspase-3in the hippocampal region after cerebral ischemia-reperfusion in rats.Methods Rats were randomly divided into the sham operation group，model group and BMSCs group.Neurological function score and TTC staining were investigated.The expressions of Livin and Caspase-3proteins were detected by using immunohistochemistry method and Western blot.The apoptosis of neural cells was detected by TUNEL.Results PKH-26labeled BMSCs were observed in the hippocampal region.Compared with that of the model group，the neurological scores and cerebral infarction volume of the BMSCs group were significantly decreased（P＜0.05），and the apoptotic index and the expression of Caspase-3protein were significantly decreased in the BMSCs group（P＜0.05），but the expression of Livin protein was significantly increased（P＜0.05）.Conclusion BMSC transplantation has protective effects on cerebral ischemia-reperfusion，which may be related to up-regulating Livin protein，down-regulating Caspase-3protein，and thus reducing apoptosis of neural cells.

Bone mesenchymal stem cell；Cerebral ischemia-reperfusion；Livin；Caspase-3

R322.3＋2

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.003

2011-05-20

2011-09-10

黑龍江省普通高等學校青年學術骨干支持計劃項目（1152G050），黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目（2010243）

李文媛，女（1980年），漢族，講師，碩士。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）