李秋影(綜述)，李欣欣，周王誼，莫紅梅，郭治昕※(審校)

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2.天津天士力研究院藥理毒理所，天津300410)

血管環(huán)研究起始于1980年，Robert F.Furchgott教授把血管條改成血管環(huán)模型，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞可釋放一種使血管舒張的因子，即一氧化氮(nitric oxide，NO)。他因而獲得了1998年度諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。從此，離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用，用于基礎(chǔ)研究、新藥研發(fā)等領(lǐng)域。根據(jù)文獻(xiàn)的調(diào)研，目前國內(nèi)開展血管環(huán)實(shí)驗(yàn)研究的主要單位有以下7個:中南大學(xué)藥學(xué)院(發(fā)表文獻(xiàn)300篇)、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部(發(fā)表文獻(xiàn)247篇)、北京醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室(發(fā)表文獻(xiàn)220篇)、中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)研究室(發(fā)表文獻(xiàn)169篇)、同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室(發(fā)表文獻(xiàn)157篇)、中國藥科大學(xué)(發(fā)表文獻(xiàn)73篇)及第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院(發(fā)表文獻(xiàn)62篇)。

1 血管環(huán)的研究背景

血管環(huán)研究起始于研究血管釋放物質(zhì)，發(fā)展30余年至今已發(fā)生了巨大的變化。在發(fā)展的過程中，很多變量和新的實(shí)驗(yàn)方法被發(fā)明，并引入到后續(xù)研究之中?，F(xiàn)已發(fā)展成為含有去內(nèi)皮、無鈣、無氧等多種模型的一系列實(shí)驗(yàn)平臺。血管環(huán)也從主動脈血管環(huán)擴(kuò)展到肺動脈血管環(huán)、基底動脈環(huán)、腎動脈血管環(huán)等。隨著體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，血管環(huán)還被用于觀察血管生成、腫瘤發(fā)生、遷移、浸潤機(jī)制等相關(guān)研究，并為開發(fā)抗腫瘤藥物提供了一個新的平臺。

血管環(huán)實(shí)驗(yàn)的檢測指標(biāo)，亦不再局限于血管的張力研究。在檢測方法上，生理記錄儀、比色法、酶聯(lián)免疫法、成像技術(shù)等均已廣泛應(yīng)用在其中。

2 血管環(huán)的研究內(nèi)容

血管環(huán)的研究分為兩大類:第一類為血管收縮活性研究，主要應(yīng)用在心腦血管病變的探索上，檢測指標(biāo)有血管張力，以及鈣離子、內(nèi)皮素、NO、前列腺素E合成酶等調(diào)節(jié)因子;第二類為血管生成活性的研究，主要應(yīng)用于抗腫瘤研究和傷口愈合及器官移植等方面，檢測指標(biāo)有新毛細(xì)血管的生成數(shù)量，以及相關(guān)的調(diào)節(jié)因子的水平等。

2.1 血管收縮活性研究 各部位血管通過舒縮活動調(diào)節(jié)相應(yīng)組織器官血流灌注，保證各組織器官正常的生理功能。當(dāng)血管的舒縮活性出現(xiàn)異常時，機(jī)體也會發(fā)生相應(yīng)的病理改變。因此，利用離體血管環(huán)來研究因血管活性異常而產(chǎn)生的各種疾病是一種不可多得的好方法。目前，胸主動脈環(huán)、腦基底動脈環(huán)在心腦血管藥物的作用機(jī)制研究中有著廣泛的應(yīng)用。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管舒張中發(fā)揮著重要的作用，內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO及前列環(huán)素可引起血管舒張，對調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)起重要作用，因此血管環(huán)也用于血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性的評價。

2.1.1 高血壓研究 很多研究者將調(diào)節(jié)血壓的重任落到血管的舒張上，因此腎性高血壓、自發(fā)性高血壓、肺動脈高壓等疾病的作用機(jī)制以及相關(guān)的新藥開發(fā)領(lǐng)域，均充分利用血管環(huán)模型進(jìn)行研究。

腎動脈張力是調(diào)節(jié)血管外周阻力的重要因素，腎血管阻力增高是高血壓病時腎血流動力學(xué)改變的重要特征。腎動脈的病變導(dǎo)致管腔的狹窄進(jìn)而腎臟缺血刺激腎臟皮質(zhì)內(nèi)球旁裝置細(xì)胞分泌腎素過度，引發(fā)腎素血管緊張素系統(tǒng)過度激活，全身小動脈收縮血壓升高，導(dǎo)致腎血管性高血壓?？梢娔I動脈的張力在高血壓病和腎血管性高血壓的發(fā)病過程中起重要作用。離體腎動脈血管環(huán)為該領(lǐng)域提供了很好的工具。莊紅等［1］采用兩腎一夾高血壓大鼠模型，在造模8周后，取大鼠的離體主動脈，制成動脈環(huán)，觀察小分子活性肽Apelin對其的舒張作用。結(jié)果表明，Apelin-13具有顯著的舒張主動脈的作用，并且對高血壓大鼠血管環(huán)的舒張作用更強(qiáng)，提示Apelin-13在血管的保護(hù)作用中扮演著重要角色。

肺動脈高壓是慢性阻塞性肺疾病的病理生理關(guān)鍵環(huán)節(jié)。諸多致病因素參與了肺動脈高壓的發(fā)生與發(fā)展并最終引起血管收縮，導(dǎo)致血管重塑。肺動脈血管環(huán)已被廣泛地應(yīng)用于抗肺動脈高壓藥物活性地評價。李倩等［2］通過組織浴槽血管環(huán)法觀察Kv3.4通道特異性阻斷劑 BDS-I對15-羥二十碳四烯酸(15-hydroxyeicosatetraenoic acid，15-HETE)收縮肺動脈血管的影響，15-HETE引起肺動脈血管環(huán)張力增加，呈劑量依賴性;對缺氧組的大鼠肺動脈血管環(huán)張力作用更為明顯，與對照組比較有顯著性差異;除去肺動脈血管內(nèi)皮后，15-HETE引起血管收縮的強(qiáng)度較內(nèi)皮完整時增強(qiáng)，呈劑量依賴性收縮反應(yīng);通過阻斷Kv3.4通道從而抑制收縮肺動脈血管環(huán)收縮。研究結(jié)果提示，Kv3.4通道參與由15-HETE引起的缺氧性肺動脈血管收縮。另有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Wistar大鼠和SD大鼠肺動脈血管環(huán)對缺氧(缺氧10 min)的反應(yīng)不同，SD大鼠僅出現(xiàn)收縮反應(yīng)，而Wistar大鼠在收縮前出現(xiàn)內(nèi)皮依賴性舒張。

自發(fā)性高血壓領(lǐng)域的血管環(huán)實(shí)驗(yàn)研究更多，大部分都是利用自發(fā)高血壓大鼠進(jìn)行研究。待動物的血壓升高至一定的水平時，取材血管，制作血管環(huán)標(biāo)本，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Ishida等［3］從mRNA和蛋白質(zhì)水平證實(shí)了G蛋白耦聯(lián)受體APJ及內(nèi)源性配基Apelin在血管平滑肌有表達(dá)。Apelin可與血管內(nèi)皮層的G蛋白耦聯(lián)受體APJ受體結(jié)合，激活一氧化氮合酶，釋放NO引起血管舒張，降低大鼠平均動脈血壓［4］。Apelin對于剝除內(nèi)皮的離體隱靜脈也具有較強(qiáng)的收縮血管作用，其作用強(qiáng)度與AngⅡ相當(dāng)。

劉廠輝等［5］研究G蛋白耦聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體Apelin-13對自發(fā)性高血壓大鼠離體血管環(huán)的血管收縮和舒張反應(yīng)，以及與NO和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系。結(jié)果顯示，Apelin-13對于內(nèi)皮完整的血管表現(xiàn)出濃度依賴性舒張作用。而對于去內(nèi)皮血管則表現(xiàn)為收縮血管的作用。Apelin-13預(yù)孵育，可以減少自發(fā)性高血壓大鼠和同源的WKY大鼠血管對新福林的縮血管反應(yīng)性，增加對乙酰膽堿的舒張反應(yīng)性;進(jìn)而證實(shí)了NO通路和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)Apelin-13的舒張血管作用。

2.1.2 充血性心力衰竭 充血性心力衰竭的一個主要原因是體循環(huán)或者局部的血壓過高，因此對血管舒張活性的調(diào)節(jié)也是一個重要的方面。氨氯吡咪是一種保鉀利尿劑，臨床用于利尿消腫、心源性水腫和非心源性水腫的治療。陳媛等［6］采用KCl或者去甲腎上腺素預(yù)收縮的去內(nèi)皮或者內(nèi)皮完整的離體大鼠主動脈環(huán)，研究結(jié)果表明氨氯吡咪的血管舒張作用具有內(nèi)皮依賴性，與內(nèi)皮NO的合成有關(guān);同時氨氯吡咪可能涉及血管平滑肌細(xì)胞的鈣激活鉀通道和內(nèi)向整流鉀通道的激活。

2.1.3 冠心病 冠心病涉及小動脈的痙攣，如何防止痙攣并使之再舒張是防治冠心病的一大措施，相應(yīng)血管環(huán)的研究也已經(jīng)大量開展。王延震等［7］分離了老齡和幼年犬的冠狀動脈，進(jìn)行17β-雌二醇對離體血管環(huán)收縮反應(yīng)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)老齡犬冠狀動脈血管環(huán)對雌激素的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于幼年犬，電壓依賴性鈣通道明顯老化。

2.1.4 血管調(diào)控因子和離子通道研究 血管環(huán)的收縮舒張和很多血管調(diào)控因子有關(guān)，包括內(nèi)皮性的各種因子，作用在平滑肌上的因子，以及鉀離子通道、鈣離子通道等。激活或者阻斷某些調(diào)控的途徑，可以引起血管的收縮或者舒張，因此利用血管環(huán)來進(jìn)行機(jī)制研究也成為一種重要的手段。Francoise Goirand等采用C57B16小鼠來研究ATP依賴性蛋白激酶(AMP-dependent protein kinase，AMPK)亞型對小鼠胸主動脈的舒張作用。采用的小鼠是ATP依賴性蛋白激酶催化的 α1亞型缺失(AMPKα1－/－)或者ATP依賴性蛋白激酶催化的 α2亞型缺失小鼠，以及其同窩的對照小鼠。采用苯腎上腺素預(yù)收縮，然后加入梯度濃度的5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside，AICAR)來考察 AMPK 的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AICAR可以劑量依賴性地舒張預(yù)收縮的C57B16、ATP依賴性蛋白激酶催化的α1亞型AMPKα1+/+和ATP依賴性蛋白激酶催化的α2亞型AMPKα2+/+無缺失的小鼠的動脈血管環(huán)，這個舒張作用并不被腺苷受體拮抗劑所阻斷。去除血管的內(nèi)皮后，這個舒張作用依然存在，說明AICAR的作用靶點(diǎn)是平滑肌細(xì)胞。用L-單甲基精氨酸阻斷一氧化氮的合成后，AICAR仍然可以引起血管的舒張，說明它也不依靠一氧化氮系統(tǒng)來舒張血管。AMPKα1－/－小鼠的動脈環(huán)對AICAR沒有任何舒張反應(yīng)，提示是AMPKα1的活性非內(nèi)皮依賴性和非eNOS依賴性介導(dǎo)血管舒張作用［8］。

劉飛君等［9］利用大鼠腎動脈血管環(huán)、腹主動脈血管環(huán)、腦動脈環(huán)、冠狀動脈血管環(huán)探討藥物是否具有器官血管選擇性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KB-R7943濃度依賴性地舒張高鉀除極所致的成年大鼠各器官動脈血管環(huán)，對各臟器血管無顯著選擇性。

2.1.5 腦供血不足 腦血管的血流量巨大，缺氧及一些內(nèi)源性物質(zhì)可引起動脈痙攣，腦供血不足，最終導(dǎo)致腦組織缺血及變性壞死。Edvinsson等［10］采用大鼠腦動脈模型進(jìn)行降鈣素基因相關(guān)肽抗體的研究，發(fā)現(xiàn)抗體的作用呈現(xiàn)內(nèi)皮依賴性。作用于平滑肌細(xì)胞的α或β降鈣素基因相關(guān)肽均可引起大腦中動脈濃度依賴的血管舒張。

此外，還可利用家兔腦錐基底動脈環(huán)，研究各種因素引起的血管收縮反應(yīng)的影響。

2.1.6 內(nèi)毒素休克 內(nèi)毒素休克(endotoxic shock，ES)可引起急性循環(huán)功能衰竭，其病理學(xué)基礎(chǔ)是細(xì)菌釋放內(nèi)毒素導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)，肺臟首發(fā)受累，最終以急性呼吸窘迫綜合征、多系統(tǒng)器官功能衰竭危及患者生命。血管反應(yīng)性改變是ES的主要病理特征之一。其中，血管對縮血管劑的反應(yīng)性減弱或血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)降低，都是血壓反應(yīng)性下降及循環(huán)衰竭的重要原因之一，并與ES患者病死率居高不下密切相關(guān)。血管環(huán)可較直觀地顯示血管對各種活性物質(zhì)的反應(yīng)，因此已廣泛地應(yīng)用到該領(lǐng)域。目前應(yīng)用較多的是離體肺、體動脈血管環(huán)。

佟冬怡等［11］采用脂多糖孵育離體家兔肺動脈環(huán)和體動脈環(huán)建立ES模型。研究去甲腎上腺素和多巴胺對正常以及內(nèi)毒素孵育后體動脈和肺動脈的血管張力反應(yīng)性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ES時，去甲腎上腺素在提升體動脈張力的同時，也同樣程度地提升肺動脈張力，二者無顯著性差異，對內(nèi)毒素休克不利;而中劑量的多巴胺可使內(nèi)毒素孵育肺動脈收縮減弱而體動脈收縮加強(qiáng)，對ES時的肺動脈高反應(yīng)性和體動脈低反應(yīng)性有利。

2.1.7 藥物作用機(jī)制研究 離體血管環(huán)也較廣泛地運(yùn)用于藥物作用機(jī)制的研究，例如復(fù)方丹參滴丸、杭白菊總黃酮、參麥注射液、黃芪、金雀異黃素、苦碟子、滿山紅水提物等。

王紅娟等［12］利用家兔的主動脈血管環(huán)，對大豆黃酮的血管收縮作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)大豆黃酮通過激活內(nèi)皮上的M受體釋放NO等引起舒張作用，該作用和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿相似，具有內(nèi)皮依賴性。秦綱等［13］從疾病預(yù)防的角度出發(fā)，利用大鼠的離體胸主動脈，觀察大氣PM2.5(也稱細(xì)顆粒物，是指大氣中空氣動力學(xué)直徑＜2.5 μm的粒子，這種污染物主要產(chǎn)生于交通、制造、能源等行業(yè)的高溫燃燒過程中)。大量流行病學(xué)資料證明，PM2.5與心血管疾病發(fā)病、死亡密切相關(guān)。研究結(jié)果證明PM2.5可以加強(qiáng)PE對血管環(huán)的收縮作用，其機(jī)制可能與其通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)。

二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)是一種含硫有機(jī)化合物，因其能溶解絕大多數(shù)有機(jī)化合物，因此作為反應(yīng)溶劑廣泛用于生物科研實(shí)驗(yàn)。王葉紅等［14］研究了DMSO對離體大鼠胸主動脈的收縮反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)DMSO預(yù)處理后可以使氯化鈣的量效曲線右移，提示DMSO可能通過抑制血管平滑肌細(xì)胞的鈣離子通道而引起血管舒張。

2.2 血管生成活性研究 血管生成在很多生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤的生長和遷移，銀屑病的發(fā)病等都與血管生成具有很大的關(guān)系。因此，目前利用血管環(huán)進(jìn)行血管生成活性研究也是熱點(diǎn)之一。近年來，評價抑制和促進(jìn)血管生成的方法也有很大的進(jìn)步，在分子水平、細(xì)胞水平、器官組織水平以及整體動物水平都建立了相應(yīng)的模型，以評價血管生成的活性，形成機(jī)制以及藥物作用靶點(diǎn)等。細(xì)胞水平測定，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞模型［15］及內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)模型［16］。在器官組織水平經(jīng)典的血管生成模型主要有雞胚絨毛膜尿囊［17］、動物虹膜和無血管的角膜［18］等血管生成的體內(nèi)器官組織模型。還有一種介于細(xì)胞水平和器官組織水平之間的培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)血管生成模型［19］。

2.2.1 抗腫瘤 血管生成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步研究腫瘤血管生成及其調(diào)控機(jī)制，分析血管生成促進(jìn)或抑制因子活性的影響，驗(yàn)證針對血管生成進(jìn)行的腫瘤治療措施等，必須建立起腫瘤血管生成的研究模型。與體外實(shí)驗(yàn)相比，在體的血管生成實(shí)驗(yàn)雖然更貼近生理狀態(tài)，但是耗時、費(fèi)力、昂貴。體外的血管環(huán)生成實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被證明和生理狀態(tài)環(huán)境具有一定的吻合性。

1984年，Nicosia首次報道動脈環(huán)血管生成模型;1990年，Nicosia等［19］首次將此模型應(yīng)用到血管發(fā)生的研究中。取下大鼠主動脈后，剪成1 mm寬的血管環(huán)，再用纖維蛋白膠或者膠原蛋白膠包埋，然后以無血清的MCDB131培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每天計(jì)算主動脈環(huán)產(chǎn)生的新生微血管數(shù)并進(jìn)行定量分析。用不同膠培養(yǎng)的大鼠主動脈環(huán)新生血管的生長曲線不同。膠原包埋的主動脈環(huán)，培養(yǎng)1周時血管數(shù)達(dá)到頂峰，第2周開始萎縮。用纖維蛋白膠包埋時能使血管數(shù)頂峰期維持更長，且新生血管數(shù)是前者的2倍。

2002年Zhu等［20］將此方法改進(jìn)，采用更薄的膠層包埋動脈環(huán)，使新生成血管染色更加方便;應(yīng)用雙重染色法和共聚焦顯微鏡在同一個層面上觀察到內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及外周細(xì)胞共同存在并證明新生血管主要由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成。方法學(xué)的改進(jìn)有利于血管生物學(xué)家更深入地研究血管生成的機(jī)制。動脈環(huán)取材廣泛，觀察方法簡單，可以從分子水平闡明血管生長的分子調(diào)控機(jī)制，是較好的體外血管生成模型。

2004年 Wang等［21］建立了一種簡明、可重復(fù)、可定量的新的技術(shù)來進(jìn)行新生血管的定量分析，采用三維立體培養(yǎng)動脈環(huán)，用比色法來完成血管生成活性的定量測定。使用了常用的工具藥如舒拉明、紫杉酮等作為受試物，通過與成像分析方法結(jié)果的對比，比色法的結(jié)果被證明是穩(wěn)定可靠并可重復(fù)的。

2.2.2 動靜脈吻合 對大鼠動脈環(huán)和下腔靜脈環(huán)進(jìn)行共培養(yǎng)，能形成微血管的吻合網(wǎng)絡(luò)，因此，可用此模型來研究動靜脈吻合發(fā)生的分子機(jī)制。但它不能完全真實(shí)反映腫瘤生長的微血管環(huán)境。另外，從不同種屬和不同大小的動物體內(nèi)取出的動脈環(huán)血管生成數(shù)差別很大，不好類比［22］。

3 結(jié)語

在新藥的篩選和基礎(chǔ)研究中，血管環(huán)的研究都是一個很重要的位置。在體動物研究完全是生理狀態(tài)，可信度高，但是資源和時間方面耗資巨大。分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)耗資小，可以快速進(jìn)行篩選，但是和生理狀態(tài)的差距過大，存在很大的局限性，而血管環(huán)這種半離體實(shí)驗(yàn)，處于一個承接的位置。和離體心臟研究、離體臟器(肝、腎、肺)研究一起，成為一個器官篩選平臺，連接細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)(包括分子生物學(xué))和整體動物實(shí)驗(yàn)之間的通道，發(fā)揮著越來越重要的作用。血管環(huán)模型即將聯(lián)合分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)等領(lǐng)域的先進(jìn)技術(shù)，不斷改進(jìn)創(chuàng)新，為相關(guān)科學(xué)研究提供更多的支持。

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