禹曉東(綜述)，許向東(審校)

(解放軍第三醫(yī)院骨科，陜西寶雞721004)

目前，脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后的凋亡信號(hào)傳遞機(jī)制仍未完全明確。因此，了解SCI后上游凋亡信號(hào)如何傳遞以及傳遞途徑中的關(guān)鍵蛋白顯得尤為重要。這有利于針對性的選擇治療策略以減輕損傷、恢復(fù)神經(jīng)功能。眾多的研究中，越來越多的目光集中于腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)家族，TNFR家族廣泛地參與由炎性反應(yīng)和淋巴細(xì)胞激活導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和其他類型的程序性細(xì)胞死亡，依照不同的細(xì)胞類型及環(huán)境因素，這些受體產(chǎn)生不同的信號(hào)反應(yīng)。

最近的研究揭示了TNFR家族的兩個(gè)成員，即TNFR-1和Fas信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞定位［1］。胞外的多種生物化學(xué)信號(hào)通過TNFR-1和Fas復(fù)合體轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞內(nèi)，引起細(xì)胞凋亡。最近的一項(xiàng)研究中，將剔除TNFR-1和Fas或封閉TNFR-1和Fas與其配體的相互作用的動(dòng)物制作SCI模型，與對照組相比，其神經(jīng)功能評分明顯升高［2］。

1 Fas信號(hào)通路

Fas(CD95，Apo-1)屬于Ⅰ型跨膜蛋白，隸屬于TNFR家族，是已知的6個(gè)死亡受體之一。其胞外部分包含三個(gè)富半胱氨酸區(qū)域(cysteine-rich domains，CRDs)，其中CRD 1是Fas配體結(jié)合區(qū)域，當(dāng)Fas構(gòu)成三聚體后，可與Fas配體結(jié)合，CRD 2和CRD 3也在Fas與其配體的結(jié)合中發(fā)揮重要作用［3］。Fas在胞內(nèi)的部分稱為死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)，通過可與其結(jié)合的蛋白傳遞早期凋亡信號(hào)。Fas的典型配體稱為 FasL(CD95L，Apo-1L，CD178，TNFSF6)，這是一個(gè)281氨基酸長度的Ⅱ型跨膜蛋白，特異性的定位于免疫細(xì)胞和CNS細(xì)胞膜上［4］。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，F(xiàn)as的激活可以引發(fā)神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡［5］。目前對于淋巴細(xì)胞凋亡中經(jīng)Fas途徑的信號(hào)傳遞機(jī)制已比較清楚，但對其在CNS內(nèi)的信號(hào)傳遞方式及其時(shí)空定位仍未完全明確。但無論如何，F(xiàn)as和FasL在SCI后的神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，這是毋庸置疑的。眾多研究揭示，F(xiàn)as與FasL無論是在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，還是在體內(nèi)CNS內(nèi)均有表達(dá)，但表達(dá)水平在正常狀態(tài)下極其低下。與其相反，包括SCI在內(nèi)的多種CNS損傷或疾病狀態(tài)下，可檢測到Fas與FasL表達(dá)水平的顯著升高［6］。

新的試驗(yàn)證據(jù)顯示，應(yīng)用FasL的中和劑可以顯著減少SCI后神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡數(shù)量和凋亡范圍。試驗(yàn)中，SCI大鼠于傷后使用FasL的單克隆抗體處理，數(shù)周后測量其后肢運(yùn)動(dòng)功能與動(dòng)作誘發(fā)電位，均優(yōu)于未經(jīng)任何處理的對照組，對其脊髓標(biāo)本進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，其神經(jīng)纖維的再生數(shù)量與生長相關(guān)蛋白43表達(dá)水平均高于對照組［7］。Yoshino等［8］采用剔除Fas和FasL的轉(zhuǎn)基因鼠制作SCI模型，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，轉(zhuǎn)基因鼠SCI后損傷范圍減小、細(xì)胞凋亡數(shù)量減少、神經(jīng)功能恢復(fù)速度增加。這說明Fas和FasL在SCI后的神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究:損傷后FasL的來源及其作用靶位需進(jìn)一步明確;損傷后軸突再生與運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的相關(guān)性亦需深入探討;再者，在上述試驗(yàn)中，F(xiàn)asL抗體是于損傷后即刻應(yīng)用，那么，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)說明FasL抗體最晚可于損傷后多久應(yīng)用才能取得理想的治療效果，這有利于制訂精確的藥物治療方案。

Fas介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由死亡介導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(death-inducing signal complex，DISC)完成，包括 Fas、Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(Fas-associated death domain，F(xiàn)ADD)、caspase-8、caspase-10。其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在不同類型的細(xì)胞內(nèi)存在差異。在“Ⅰ型”細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)as激活后DISC表達(dá)量高，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，且其介導(dǎo)的凋亡過程不能被Bcl-2家族蛋白阻斷;而在“Ⅱ型”細(xì)胞內(nèi)，DISC在Fas激活后表達(dá)量較低，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低，凋亡過程可被Bcl-2家族蛋白阻斷［9］。CNS內(nèi)為何存在兩種不同的Fas凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，其分子機(jī)制仍不明確。

Fas在細(xì)胞膜上的定位差異可能是存在兩種不同轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的原因之一。將T細(xì)胞膜上的Fas蛋白通過特殊技術(shù)轉(zhuǎn)移到某一特定區(qū)域后，其在相同胞外信號(hào)強(qiáng)度刺激下的凋亡數(shù)量明顯增加［10］。進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)，在“Ⅰ型”細(xì)胞中，一部分Fas定位于胞膜的卵磷脂區(qū)域內(nèi)，而在“Ⅱ型”細(xì)胞中，全部Fas均未定位于卵磷脂區(qū)域。正是定位于卵磷脂區(qū)域的Fas可介導(dǎo)“Ⅰ型”細(xì)胞在極低強(qiáng)度的胞外信號(hào)作用下發(fā)生凋亡，而同樣強(qiáng)度的信號(hào)并不能導(dǎo)致“Ⅱ型”細(xì)胞的凋亡［11］。那么，CNS內(nèi)是否明確存在“Ⅰ型”和“Ⅱ型”細(xì)胞以及為何卵磷脂區(qū)域可以提高Fas對凋亡信號(hào)的敏感性尚需進(jìn)一步的研究?？梢韵胂?，進(jìn)一步深入對Fas和FasL及其作用靶位的研究將極大地推動(dòng)SCI治療的進(jìn)展。

2 阻斷Fas信號(hào)通路的研究進(jìn)展

人們已經(jīng)對數(shù)種阻斷了Fas信號(hào)途徑的細(xì)胞模型進(jìn)行了詳細(xì)的研究，包括將細(xì)胞膜上的Fas溶解或是使細(xì)胞分泌可以競爭性地結(jié)合FasL的蛋白。研究者采用腺病毒蛋白E3降解Fas后，觀測到了細(xì)胞凋亡率的降低［12］。此外，蛋白激酶C也可以調(diào)節(jié)Fas介導(dǎo)的凋亡過程，蛋白激酶C活化后通過減少Bid蛋白的活化抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。值得注意的是，這種效應(yīng)僅出現(xiàn)于“Ⅱ型”細(xì)胞，而在“Ⅰ型”細(xì)胞中并無任何影響［13］。由此推測，蛋白激酶C可能是通過影響B(tài)cl-2蛋白表達(dá)來達(dá)到抑制凋亡的目的。

細(xì)胞內(nèi)的長鏈型FLIP(FLICE-like inhibitory protein long form，c-FLIPL)近來日益受到重視，c-FLIPL包含一個(gè)死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，在Fas介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路中可能同時(shí)扮演了啟動(dòng)子與沉默子的角色［14］。除c-FLIPL之外，另外一種被稱為lifeguard的蛋白也可以阻斷Fas介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路，lifeguard可以直接結(jié)合于Fas受體上，阻止Fas和FasL之間的結(jié)合［15］。在大鼠體內(nèi)，lifeguard的同源蛋白又被稱為神經(jīng)膜蛋白35，它隨著大鼠CNS的發(fā)育表達(dá)量不斷上調(diào)，并且在成年大鼠的脊髓內(nèi)呈穩(wěn)定的高表達(dá)狀態(tài)，尤其在數(shù)種類型的神經(jīng)元樹突中表達(dá)量最高［16］。研究發(fā)現(xiàn)，lifeguard蛋白的表達(dá)主要受磷脂酰肌醇3激酶-AKT/PKB途徑的調(diào)節(jié)［17］。在大鼠體內(nèi)，lifeguard蛋白在小腦的顆粒樣神經(jīng)元中表達(dá)量最高，而對這類顆粒樣神經(jīng)元的體外培養(yǎng)也證實(shí)，其具有對抗Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的能力［18］。而進(jìn)一步的試驗(yàn)中，研究者采用編碼lifeguard蛋白mRNA的反義寡核苷酸對培養(yǎng)的大鼠小腦顆粒樣神經(jīng)元進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以及采用RNA沉默技術(shù)使lifeguard蛋白的表達(dá)量下調(diào)，均檢測到了細(xì)胞對Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性的升高以及Fas下游caspase-8活化量的增加［19］。這說明lifeguard蛋白在顆粒樣神經(jīng)元對抗Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了重要作用，至于lifeguard蛋白是否也會(huì)在其他類型的神經(jīng)元中發(fā)揮類似的凋亡保護(hù)作用，尚需進(jìn)一步的試驗(yàn)證據(jù)。

3 TNFR信號(hào)通路

關(guān)于TNFR1和TNFR2在正?；騍CI后的脊髓內(nèi)的表達(dá)，目前仍存在爭議。Yan等［20］報(bào)道，在正常脊髓中并沒有明確的檢測到TNFR1和TNFR2的表達(dá);而與之相反，有研究發(fā)現(xiàn)，在正常脊髓的DRGn傳入纖維、背根移行區(qū)以及脊髓后角的薄層Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)均檢測到了TNFR1表達(dá)，但并無TNFR2存在證據(jù)［21］。SCI后，TNFR1 和 TNFR2的表達(dá)量顯著升高，并局限性地定位于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，這提示TNFR1和TNFR2可能在SCI后的病理學(xué)變化中發(fā)揮重要作用。在一項(xiàng)試驗(yàn)中，采用剔除TNFR1的轉(zhuǎn)基因鼠制作SCI模型，與使用野生型鼠的對照組相比，試驗(yàn)組細(xì)胞凋亡數(shù)量、神經(jīng)損傷范圍均遠(yuǎn)大于對照組，神經(jīng)功能恢復(fù)能力則較對照組為差。進(jìn)一步對兩組損傷局部進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因組出現(xiàn)了核因子κB結(jié)合活性的降低，同時(shí)還有cIAP-2表達(dá)量的降低以及caspase-3活化的增加。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在剔除編碼TNFR2蛋白序列的轉(zhuǎn)基因鼠SCI模型中［22］。以上的研究結(jié)果支持了TNFR1和TNFR2可能在SCI后限制細(xì)胞凋亡范圍的觀點(diǎn)。

有研究顯示，TNFR1信號(hào)途徑包含兩個(gè)分子結(jié)構(gòu)和空間定位都不相同的分子復(fù)合體，這兩個(gè)復(fù)合體分別激活核因子κB與caspase系統(tǒng)［23］。在凋亡信號(hào)傳遞早期，TNF與 TNFR1結(jié)合后，一個(gè)包括TRADD、RIP1、TRAF1、TRAF2 和 cIAP-1 的 TNFR 受體相關(guān)復(fù)合體Ⅰ開始啟動(dòng)并轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外信號(hào)，引發(fā)核因子κB的活化，參與抑制凋亡進(jìn)程。而另外一個(gè)復(fù)合體Ⅱ則存在于胞質(zhì)內(nèi)，與TNFR分離，由TRADD、RIP1、FADD和caspase-8組成，參與另外一條TNFR1相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。當(dāng)復(fù)合體Ⅰ轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外信號(hào)，引發(fā)核因子κB的活化數(shù)量足夠時(shí)，胞內(nèi)的抗凋亡機(jī)制激活，復(fù)合體Ⅱ中caspase-8的活化受到抑制;而當(dāng)復(fù)合體Ⅰ轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外信號(hào)，引發(fā)核因子κB的活化數(shù)量微少時(shí)，復(fù)合體Ⅱ中的caspase-8則開始活化，參與促進(jìn)凋亡進(jìn)程。由此可見，核因子κB的活化數(shù)量是決定復(fù)合體Ⅱ是否參與TNFR1相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、從而誘導(dǎo)凋亡的最關(guān)鍵因素。

SCI后，脊髓神經(jīng)元TNFR1相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，其結(jié)局究竟是存活還是凋亡?最近的試驗(yàn)對其進(jìn)行了更加深入的研究［24］。結(jié)果顯示，有一部分TNFR1定位于細(xì)胞膜上的卵磷脂區(qū)域內(nèi)。已經(jīng)證實(shí)，卵磷脂區(qū)域可作為包括FAS、TNFR1在內(nèi)的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體存在的平臺(tái)。在正常脊髓內(nèi)，TNFR1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體包括 TRADD、RIP、TRAF1、TRAF2和 cIAP-1，而已知在體內(nèi)由 TNFR1-TRADD-RIPTRAF2復(fù)合體傳遞的為細(xì)胞存活信號(hào)，由此有理由推測，TNFR1信號(hào)途徑在正常脊髓內(nèi)實(shí)際是促進(jìn)細(xì)胞存活的信號(hào)途徑。

SCI后，TNFR1快速移位至細(xì)胞膜的卵磷脂區(qū)域，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體引起一過性的核因子κB活化數(shù)量增加，然后RIP和cIAP-1自TNFR1上解離，而cIAP-2、FADD則與TNFR1結(jié)合，開始介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［25］。由此認(rèn)為，TNFR1信號(hào)途徑在正常脊髓內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞存活，而在SCI后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這種變化是由TNFR1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體中銜接蛋白的變化導(dǎo)致的。RIP與TNFR1的解離可能是導(dǎo)致核因子κB途徑表達(dá)下調(diào)，致使細(xì)胞凋亡增加的始動(dòng)因素。而且，cIAP-1、IAP-2和TRAF1已經(jīng)被證實(shí)是核因子κB的作用靶位，SCI導(dǎo)致的核因子κB活化的下調(diào)也可能同時(shí)導(dǎo)致TNFR1-TRAF-IAP對caspase-8活化抑制能力的下調(diào)，從而使caspase-8活化增加，致使細(xì)胞凋亡。SCI后30 min，caspase-8即可被檢測出定位于TNFR1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體中，這也證實(shí)了FADD通過與TRADD結(jié)合，激活caspase-8從而誘導(dǎo)凋亡的推測［26］。有學(xué)者曾通過對培養(yǎng)狀態(tài)下神經(jīng)元的研究發(fā)現(xiàn)，TNFR1信號(hào)途徑包含兩個(gè)分子結(jié)構(gòu)和空間定位都不相同的分子復(fù)合體，分別發(fā)揮不同作用，然而在體內(nèi)試驗(yàn)中，并未發(fā)現(xiàn)這兩種復(fù)合體如同在體外般的顯著區(qū)別。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，復(fù)合體Ⅰ在SCI 30 min后即可激活 caspase-8誘導(dǎo)凋亡［27］。因此，在 SCI后，TRADD的死亡結(jié)構(gòu)域可能在FADD及caspase-8的活化過程中起著決定性的調(diào)控作用。此外，TNFR信號(hào)途徑也受到所在細(xì)胞類型、其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、遺傳與環(huán)境因素等多方面的影響。

［1］Irmler M，Thome M，Hahne M，et al.Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP［J］.Nature，1997，388(6638):190-195.

［2］Elsing A，Burgert HG.The adenovirus E3/10.4K-14.5K proteins down-modulate the apoptosis receptor Fas/Apo-1 by inducing its internalization［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(17):10072-10077.

［3］Kim GM，Xu J，Song SK，et al.Tumor necrosis factor receptor deletion reduces nuclear factor-B activation，cellular inhibitor of apoptosis protein 2 expression，and functional recovery after traumatic spinal cord injury［J］.Neurosci，2001，21(17):6617-6625.

［4］Yune TY，Kim SJ，Lee SM，et al.Systemic administration of 17-estradiol reduces apoptotic cell death and improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats［J］.Neurotrauma，2004，21(3):293-306.

［5］Li GL，F(xiàn)arooque M，Olsson Y.Changes of Fas and Fas ligand immunoreactivity after compression trauma to rat spinal cord［J］.Acta Neuropathol，2000，100(1):75-81.

［6］Wang CY，Mayo MW，Korneluk RG.NF-kappB antiapoptosis:induction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAP1 and c-IAP2 to suppress caspase-8 activation［J］.Science，1998，281(5383):1680-1683.

［7］Tan Z，Levid J，Schreiber SS.Increased expression of Fas(CD95/APO-1)in adult brain after kainite induced seizures［J］.Neuroreport，2001，12(9):1979-1982.

［8］Yoshino O，Matsuno H，Nakamura H，et al.The role of Fas-mediated apoptosis after traumatic spinal cord injury［J］.Nat Med Res，2004，29(13):1394-1404.

［9］Lotocki G，Alonso OF，Dietrich WD，et al.Tumor necrosis factor receptor 1 and its signaling intermediates are recruited to lipid rafts in the traumatized brain ［J］.Neurosci，2004，24(49):11010-11016.

［10］Springer JE，Azbil RD，Knapp PE.Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury［J］.Nat Med，1999，5(8):943-946.

［11］Martin-Villalba A，Hahne J，Kleber S，et al.Therapeutic neutralization of CD95-ligand and TNF attenuates brain damage in stroke［J］.Cell Death Differen，2001，8(7):679-686.

［12］Hsu H，SHu HB，Pan MG.TRADD-TRAF2 and TRADD-FADD interactions define two distinct TNF receptor 1 signal transduction pathways［J］.Cell，1996，84(2):299-308.

［13］Scaffidi C，Schmitz I，Zha J.Differential modulation of apoptosis sensitivity in CD95type I and type II cells［J］.Biol Chem，1999，274(32):22532-22538.

［14］Muppidi J，Siegel RM.Ligand-independent redistribution of Fas(CD95)into lipid rafts mediates clonotypic T cell death［J］.Nat Immunol，2004，5(2):182-189.

［15］Beier CP，Wishhusen J，Gleichmann M，et al.FasL(CD95L/APO-1L)resistance of neurons mediated by phosphatidylinositol 3-kinase-Akt/protein kinase B dependent expression of lifeguard/neuronal membrane protein35［J］.Neurosci，2005，25(29):6765-6774.

［16］Peter ME.The flip side of FLIP［J］.Biochem，2004，382(Pt 2):e1-e3.

［17］Micheau O，Tschopp J.Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes［J］.Cell，2003，114(2):181-190.

［18］Schwenzer R，Siemienski K，Liptay S，et al.The human tumor necrosis factor(TNF)receptor-associated factor 1 gene(TRAF1)is upregulated by cytokines of the TNF ligand family and modulates TNF-induced activation of NF-kappaB and c-Jun N-terminal kinase［J］.Biol Chem，1999，274(27):19368-19374.

［19］Pitti RM，Marsters SA，Lawrence DA，et al.Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer［J］.Nature，1998，396(6712):699-703.

［20］Yan P，Liu N，Kim GM，et al.Expression of type 2 and type 2 receptors for tumor necrosis factor after traumatic spinal cord injury in adult rats［J］.Exp Neurol，2003，183(2):286-297.

［21］Schweitzeer B，Suter U，Taylor V.Neural membrane protein 35/lifeguard is localized at postsynaptic sites and in dendrites［J］.Mol Brain Res，2002，107(1):47-56.

［22］Raoul C，Estevez AG，Nishimune H，et al.Motoneuron death triggered by a specific pathway downstream of Fas potentiation by ALS-linked SOD1 mutations［J］.Neuron，2002，35(6):1067-1083.

［23］Peter ME，Krammer PH.The CD95(APO-1/Fas)DISC and beyond［J］.Cell Death Differ，2003，10(1):26-35.

［24］Scaffidi C，F(xiàn)ulda S，Srinivasan A，et al.Two CD95(APO-1/Fas)signaling pathways［J］.EMBO J，1998，17(6):1675-1687.

［25］Varfolomeev EE，Ashkenazi A.Tumor necrosis factor:an apoptotic junkie? ［J］.Cell，2004，116(4):491-497.

［26］Busch SA，Silver J.The role of extracellular matrix in CNS regeneration［J］.Curr Opin Neurobiol，2007，17(1):120-127.

［27］Waldner H，Sobel RA，Howard E.Fas-and FasL-deficient mice are resistant to induction of autoimmune encephalomyelitis［J］.J Immunol，1997，159(7):3100-3103.