尹將來，馬 瑛，賈紅華，周 華，韋 萍

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009)

雜色云芝菌產(chǎn)漆酶條件優(yōu)化及其對堿性紫5BN的降解

尹將來，馬 瑛，賈紅華，周 華，韋 萍

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009)

通過實(shí)驗(yàn)對雜色云芝菌產(chǎn)漆酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明雜色云芝菌產(chǎn)漆酶的最佳發(fā)酵條件為:以質(zhì)量濃度為15 g/L的羧甲基纖維素鈉和質(zhì)量濃度為1.25 g/L的葡萄糖作為復(fù)合碳源，以質(zhì)量濃度為15 g/L的酵母膏作為氮源，在發(fā)酵72 h時(shí)加入濃度為2 mmol/L的2，5－二甲基苯胺，發(fā)酵96 h時(shí)加入濃度為2 mmol/L的Cu2+。發(fā)酵培養(yǎng)168 h后酶活力達(dá)到3 319.2 U/mL。采用該菌株產(chǎn)漆酶對堿性紫5BN溶液進(jìn)行脫色處理，當(dāng)漆酶粗酶液酶活力為0.01 U/mL時(shí)，反應(yīng)10 h，脫色率可達(dá)93.91%。

云芝菌;漆酶;發(fā)酵;堿性紫5BN;脫色

漆酶［1－3］是一種含銅的多酚氧化酶，最早由日本人吉田于1883年從漆樹汁液中發(fā)現(xiàn)并因此得名，直至1985年被法國人Bertrand確定為含金屬的氧化酶類［4］。漆酶廣泛分布于真菌、高等植物和昆蟲中，特別是在一些真菌，如擔(dān)子菌、多孔菌、子囊菌等中發(fā)現(xiàn)的較多。此外，在一些高等動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了漆酶，如Manuel等［5］從牛胃中鑒定獲得一新的漆酶。

隨著工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，染料廢水因色度高、堿性大、難降解、水量大等特點(diǎn)成為較難治理的工業(yè)廢水［6－8］。堿性紫5BN作為三苯甲烷類染料，被廣泛應(yīng)用于紡織、印染、油墨等工業(yè)領(lǐng)域。采用物化法降解堿性紫5BN運(yùn)行費(fèi)用高，藥劑加入量大，且產(chǎn)生大量難處理的污泥［9－10］。酶催化反應(yīng)由于反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)效率高、操作范圍寬，受到越來越多研究者的關(guān)注。漆酶在催化過程中產(chǎn)生的惟一副產(chǎn)物是水，因此成為環(huán)境保護(hù)用酶的研究熱點(diǎn)［11－13］。目前，國內(nèi)外對于漆酶降解廢水中有機(jī)物的研究展開了大量的工作，并將其應(yīng)用于難降解工業(yè)有機(jī)廢水的治理［14－16］。漆酶的主要生產(chǎn)菌株是大型絲狀真菌擔(dān)子菌中的白腐菌，這些菌株普遍存在產(chǎn)酶周期長、產(chǎn)酶量低等問題，使得漆酶的規(guī)?；瘧?yīng)用受到限制［17］。

本課題組分離得到一株漆酶生產(chǎn)量高、生長速率快、易培養(yǎng)的雜色云芝菌(Coriolus Versicolor)。本工作對該菌產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并使用粗酶液對染料堿性紫5BN進(jìn)行降解研究，為漆酶工業(yè)化生產(chǎn)及綠色應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、材料和儀器

實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純。

雜色云芝菌由本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

斜面培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度，g/L):麥芽汁30，蛋白胨3，瓊脂20。斜面培養(yǎng)基pH 5.6。

種子培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度，g/L):麥芽汁30，蛋白胨3。種子培養(yǎng)基pH 5.6。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度，g/L):葡萄糖15，酵母膏5，KH2PO41，MgSO40.25，CaCl20.05。初始發(fā)酵培養(yǎng)基pH 3.5。

HVE－50型高壓滅菌鍋:日本Hirayama公司;752型紫外－可見分光光度計(jì):上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;GL－21M型冷凍離心機(jī):上海市離心機(jī)械研究所。

1.2 漆酶粗酶液的制備

斜面培養(yǎng):將保存的菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)3 d，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

種子培養(yǎng):用滅菌后的竹簽將斜面上的菌絲刮到含有玻璃珠的30 mL無菌水中，將其打散，然后吸取2 mL菌懸液加入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在25℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min的條件下，搖床震蕩培養(yǎng)3 d。

平遙縣2014年汾河灌區(qū)渠系配套項(xiàng)目實(shí)施區(qū)域主要位于縣城西北部，涉及5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)8個(gè)行政村，包括四個(gè)片區(qū)。一是香樂鄉(xiāng)北薛靳、青落、陶屯、云家莊村4村；二是寧固鎮(zhèn)凈化、魏樂2村；三是古陶鎮(zhèn)新莊村；四是洪善鎮(zhèn)新營村。

發(fā)酵培養(yǎng):將培養(yǎng)好的種子以4%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min的條件下，搖床震蕩培養(yǎng)一定時(shí)間。

取適量發(fā)酵液在4℃、轉(zhuǎn)速為10 000 r/min的條件下離心10 min，得到上清液即為漆酶粗酶液。

1.3 堿性紫5BN溶液的脫色實(shí)驗(yàn)

將初始質(zhì)量濃度為10 mg/L的堿性紫5BN溶液加入到一定酶活力的漆酶粗酶液中，在反應(yīng)溫度為40℃、pH為3的條件下進(jìn)行脫色反應(yīng)。

1.4 分析方法

采用2，2'－連氮 －雙(3－乙基并噻 －6－磺酸)(ABTS)法測定酶活力(單位體積酶液中每1 min轉(zhuǎn)化 1 μmol ABTS 的酶量，U/mL)［18－19］;采用紫外－可見分光光度計(jì)在最大吸收波長589 nm處測定堿性紫5BN溶液的吸光度，并計(jì)算溶液脫色率。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對雜色云芝菌產(chǎn)漆酶酶活力的影響

在采用初始發(fā)酵培養(yǎng)基配方的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對漆酶酶活力的影響見圖1。由圖1可見:隨發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的延長，漆酶酶活力先增大后減小;雜色云芝菌在發(fā)酵培養(yǎng)168 h后漆酶酶活力達(dá)到最高值。說明雜色云芝菌在發(fā)酵培養(yǎng)168 h后逐步進(jìn)入了衰亡期。因此，將雜色云芝菌漆酶的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間確定為168 h。

2.2.1 單一碳源對漆酶酶活力的影響

改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的配方，考察不同碳源對漆酶酶活力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可見:以麥芽糖作為碳源時(shí)，漆酶酶活力最低;以羧甲基纖維素鈉作為碳源時(shí)漆酶酶活力最高，培養(yǎng)168 h后酶活力達(dá)37.5 U/mL。這可能是因?yàn)閺?fù)雜碳源更有利于雜色云芝菌產(chǎn)漆酶。

2.2.2 復(fù)合碳源對漆酶酶活力的影響

多糖難以被直接利用，影響菌體生長，但有利于漆酶的分泌;相反單糖則有利于菌的吸收，但不利于漆酶的分泌。因此以質(zhì)量濃度為15 g/L的羧甲基纖維素鈉與質(zhì)量濃度為2 g/L的其他碳源組成復(fù)合碳源，考察不同復(fù)合碳源對漆酶酶活力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3可見:分別以葡萄糖和蔗糖與羧甲基纖維素鈉形成復(fù)合碳源時(shí)的漆酶酶活力較高;其中以葡萄糖和羧甲基纖維素鈉作為復(fù)合碳源時(shí)，培養(yǎng)168 h后產(chǎn)漆酶酶活力可達(dá)51.5 U/mL。

以葡萄糖和羧甲基纖維素鈉作為復(fù)合碳源，在羧甲基纖維素鈉質(zhì)量濃度為15 g/L的條件下，ρ(羧甲基纖維素鈉)∶ρ(葡萄糖)對漆酶酶活力的影響見圖4。由圖4可見:隨ρ(羧甲基纖維素鈉)∶ρ(葡萄糖)的增加，漆酶酶活力先增大后減小;當(dāng)ρ(羧甲基纖維素鈉)∶ρ(葡萄糖)為12時(shí)，產(chǎn)漆酶酶活力最高達(dá)134.5 U/mL。這是由于葡萄糖作為單糖有利于雜色云芝菌的生長而被優(yōu)先利用，導(dǎo)致羧甲基纖維素鈉的利用過程滯后;隨羧甲基纖維素鈉質(zhì)量濃度的增加，過多的羧甲基纖維素鈉使培養(yǎng)基的黏性增加，影響其溶氧量，不利于菌體的生長產(chǎn)酶。因此確定復(fù)合碳源的最佳配方ρ(羧甲基纖維素鈉)∶ρ(葡萄糖)為12，即羧甲基纖維素鈉的質(zhì)量濃度為15 g/L，葡萄糖的質(zhì)量濃度為1.25 g/L。

圖4 ρ(羧甲基纖維素鈉)∶ρ(葡萄糖)對漆酶酶活力的影響

2.3 氮源對雜色云芝菌產(chǎn)漆酶酶活力的影響

改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源——酵母膏的質(zhì)量濃度，考察酵母膏質(zhì)量濃度對漆酶酶活力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。由圖5可見，當(dāng)酵母膏質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí)，漆酶酶活力最高。

圖5 酵母膏質(zhì)量濃度對漆酶酶活力的影響

2.4 誘導(dǎo)劑對雜色云芝菌產(chǎn)漆酶酶活力的影響

2.4.1 不同誘導(dǎo)劑對漆酶酶活力的影響

漆酶是一種誘導(dǎo)酶［20］，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加小分子芳香化合物作為誘導(dǎo)劑可促進(jìn)漆酶的分泌，提高漆酶產(chǎn)量。在誘導(dǎo)劑加入量為2 mmol/L的條件下，不同誘導(dǎo)劑對漆酶酶活力的影響見圖6。由圖6可見，以2，5－二甲基苯胺作為誘導(dǎo)劑對雜色云芝菌分泌漆酶的誘導(dǎo)作用最明顯，發(fā)酵168 h后漆酶酶活力達(dá)到2 305.0 U/mL，是不加誘導(dǎo)劑時(shí)的4.4倍。

2.4.2 Cu2+和誘導(dǎo)劑的加入時(shí)間對漆酶酶活力的影響

在雜色云芝菌生長前72 h加入誘導(dǎo)劑2，5－二甲基苯胺會明顯抑制菌株的生長發(fā)育，同時(shí)產(chǎn)漆酶的能力也會受到影響。這是因?yàn)榉枷慊衔飳w的生長有明顯的抑制作用，因此選擇適當(dāng)?shù)募尤霑r(shí)間十分重要。研究還表明適量加入Cu2+對真菌產(chǎn)漆酶有一定的促進(jìn)作用。在Cu2+和誘導(dǎo)劑加入量均為2 mmol/L的條件下，Cu2+和誘導(dǎo)劑的加入時(shí)間對漆酶酶活力的影響見圖7。由圖7可見，在發(fā)酵72 h時(shí)加入2，5－二甲基苯胺、發(fā)酵96 h時(shí)加入Cu2+對雜色云芝菌產(chǎn)漆酶的誘導(dǎo)作用最明顯，發(fā)酵168 h后酶活力達(dá)到3 319.2 U/mL。

2.5 漆酶對堿性紫5BN溶液的脫色作用

漆酶粗酶液酶活力對脫色率的影響見圖8。

由圖8可見，隨漆酶粗酶液酶活力的增加，染料溶液的脫色率逐漸降低。這是由于過多的漆酶與小分子介質(zhì)反應(yīng)，不僅減少了參與脫色作用的漆酶的量，同時(shí)也使ABTS喪失了作為小分子介質(zhì)促進(jìn)反應(yīng)的能力。當(dāng)漆酶粗酶液酶活力為0.01 U/mL時(shí)，反應(yīng)10 h，脫色率可達(dá)93.91%。

3 結(jié)論

a)通過對雜色云芝菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)漆酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雜色云芝菌產(chǎn)漆酶的最佳發(fā)酵條件為:以質(zhì)量濃度為15 g/L的羧甲基纖維素鈉和質(zhì)量濃度為1.25 g/L的葡萄糖作為復(fù)合碳源，以質(zhì)量濃度為15 g/L的酵母膏作為氮源，在發(fā)酵72 h時(shí)加入濃度為2 mmol/L的2，5－二甲基苯胺，發(fā)酵96 h時(shí)加入濃度為2 mmol/L的Cu2+。發(fā)酵培養(yǎng)168 h后，酶活力達(dá)到3 319.2 U/mL。

b)采用所制備的漆酶粗酶液對堿性紫5BN溶液進(jìn)行脫色處理，當(dāng)漆酶粗酶液酶活力為0.01 U/mL時(shí)，反應(yīng)10 h，脫色率可達(dá)93.91%。

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Cultivation Condition Optimization for Laccase Production from Coriolus Versicolor and Degradation of Basic Violet 5BN

Yin Jianglai，Ma Ying，Jia Honghua，Zhou Hua，Wei Ping

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing Jiangsu 210009，China)

The fermentation conditions for laccase production from Coriolus Versicolor were optimized by experiments.The optimum fermentation conditions are as follows:Using sodium carboxymethy cellulose with 15 g/L of mass concentration and glucose with 1.25 g/L of mass concentration as the complex carbon source;using yeast extract with 15 g/L of mass concentration as the nitrogen source;adding 2，5-dimethylaniline with 2 mmol/L of concentration at the fermentation time for 72 h;adding Cu2+with 2 mmol/L of concentration at the fermentation time for 96 h.When the fermentation time is 168 h，the enzyme activity can reach 3 319.2 U/mL.The solution containing basic violet 5BN was treated using the laccase produced by this strain.When the enzyme activity of the crude enzyme solution is 0.01 U/mL and the treatment time is 10 h，the decolorization rate is 93.91%.

Coriolus Versicolor;laccase;fermentation;basic violet 5BN;decolorization

X791

A

1006－1878(2011)04－0293－05

2011－01－12;

2011－03－03。

尹將來(1986—)，男，江蘇省宜興市人，碩士生，主要研究方向?yàn)樯锘?。電?13813366217，電郵leoy_yin@163.com。聯(lián)系人:周華，電話 025 －83172079，電郵 zhouhua@njut.edu.cn。

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)資助項(xiàng)目(2009CB724706);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20906048)。

(編輯 王 馨)