田玉樓，劉潔，于方

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.口腔醫(yī)學(xué)院正畸科，沈陽(yáng)110002；2.實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，沈陽(yáng)110001）

骨性反牙合畸形是常見(jiàn)的顱頜面錯(cuò)牙合畸形之一，是受遺傳和環(huán)境影響的多基因遺傳病，由在口腔面部發(fā)育的過(guò)程中某些與骨骼發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)異常導(dǎo)致［1］。目前尚無(wú)明確的遺傳性骨性反牙合遺傳易感基因，研究發(fā)現(xiàn)goosecoid同源盒基因（goosecoid homeobox，Gsc）、GLI家族鋅指2（GLI family zinc finger2，Gli2）、GLI家族鋅指3（GLI family zinc finger3，Gli3）、distal-less同源盒基因5（distal-less homeobox5，DLx5）、重組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β2（transforming growth factor-2，TGFβ2）、果蠅 Orthodentide人同源盒基因1（orthodenticle homeobox1，OTX1）等基因在不同的發(fā)育階段對(duì)下頜骨的形態(tài)發(fā)育產(chǎn)生影響［3～6］。本研究根據(jù)口腔頜面部發(fā)育規(guī)律，利用生物信息學(xué)手段選擇了一個(gè)與遺傳性骨性反牙合畸形可能相關(guān)的候選基因——OTX1（homo sapiens orthodenticle homeobox1），PCR擴(kuò)增結(jié)合測(cè)序篩查該基因外顯子的突變和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點(diǎn)的基因型分布，分析其與遺傳性骨性反牙合的相關(guān)性，為尋找遺傳性骨性反牙合易感基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2006年8月至2008年2月到中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科要求矯治反牙合的38例患者，均來(lái)自東北地區(qū)，家族中至少有2名或以上成員有同類畸形，并經(jīng)X線頭顱定位側(cè)位片測(cè)量分析確定為骨性反牙合。抽取3 mL靜脈血，2%EDTA抗凝，-70℃留存?zhèn)溆谩?00例無(wú)反牙合畸形的靜脈血由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遺傳學(xué)教研室提供，作為正常對(duì)照。

1.2 主要試劑

紅細(xì)胞裂解液、氯仿︰異戊醇（24︰1）、Tris飽和酚購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；蛋白酶K、TaKaRa PCR Amplification Kit、瓊脂糖、Genefinder核酸染料購(gòu)自大連寶生物公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）克隆篩選候選基因：在EST數(shù)據(jù)庫(kù)輸入易感區(qū)域染色體區(qū)帶信息，查找EST，Blastn分析后進(jìn)行電子克隆，與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后進(jìn)行染色體定位、基因結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)。

1.3.2 基因組DNA提取：加入紅細(xì)胞裂解液分離白細(xì)胞，蛋白酶K消化，酚-氯仿-異戊醇法提取基因組 DNA，乙醇沉淀后加入300μLTE（Tris-EDTA，pH7.4）溶液，常溫過(guò)夜，-20℃保存。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)及合成：利用Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物，由大連寶生物公司合成，具體的外顯子位置、引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物信息見(jiàn)表1。

1.3.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序：反應(yīng)總體積25 μL，其中基因組 DNA 40 ng，10×反應(yīng)緩沖液（MgCl215 mmol/L）2.5 μL，dNTP（2.0 mmol/L）2.0 μL，上下游引物（20 μmol/L） 各0.5 μL，Taq DNA 聚合酶1U。95 ℃5 min，95℃30（各引物的退火溫度詳見(jiàn)表1），72℃1 min，循環(huán)32次，72℃延伸8 min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化回收后送上海生工公司測(cè)序。采用熒光素末端標(biāo)記法，經(jīng)ABl377型全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定，BioEdit軟件分析，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，檢測(cè)SNP在患者中和正常對(duì)照組中的Hardy-Weinberg平衡情況，并統(tǒng)計(jì)SNP位點(diǎn)與遺傳性骨性反牙合的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 OTX1基因篩選

依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)選擇EST：（1）與已知基因同源性＜50%代表未克隆基因；（2）序列長(zhǎng)度＞300 bp；（3）盡可能來(lái)源于染色體易感區(qū)域，并有關(guān)于染色體定位信息的說(shuō)明；（4）序列中不含Alu重復(fù)序列。經(jīng)Blastn比對(duì)分析、EST電子延伸和拼接、電子表達(dá)譜分析和基因預(yù)測(cè)篩選到的候選基因，經(jīng)過(guò)編碼蛋白質(zhì)序列性質(zhì)、功能分析，后續(xù)研究中選用OTX1基因。

2.2 OTX1外顯子突變篩查

通過(guò)PCR擴(kuò)增，在病例組和對(duì)照組8對(duì)引物全部擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，經(jīng)測(cè)序篩查了OTX1基因全部5個(gè)外顯子的突變情況，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)任何突變。

2.3 SNP位點(diǎn)篩查結(jié)果

在外顯子5發(fā)現(xiàn)了一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)和已知的SNP比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該多態(tài)位點(diǎn)是rs17850223（表2）。該位點(diǎn)的序列為CACTCACATCACCACCCGCACCAGCT［C/G］AGCCCCATGGCACCCTCCTCCAT GG。rs17850223位點(diǎn)各個(gè)基因型的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

2.4 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，病例組和正常對(duì)照組OTX1基因rs17850223位點(diǎn)各基因型頻率的期望值與觀察值如表3所示，吻合度良好，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明群體基因遺傳平衡，收集的資料具有代表性，抽樣和分型結(jié)果是可靠的。

2.5 rs17850223位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率分布

經(jīng)χ2檢驗(yàn)病例組rs17850223位點(diǎn)CG基因型頻率為36.85%，高于對(duì)照組（17.00%），經(jīng)統(tǒng)計(jì)2者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；病例組CC基因型頻率為63.15%，對(duì)照組為81.00%；病例組未檢測(cè)到GG基因型，對(duì)照組GG基因型頻率為2.00%；病例組等位基因C和G頻率為81.57%和18.43%，對(duì)照組為89.50%和10.50%，病例組和對(duì)照組等位基因頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

骨性反牙合畸形具有明顯的家族聚集傾向，迄今為止，該疾病的遺傳易感基因尚不明確，尋找該疾病的致病基因，闡明它的分子遺傳機(jī)制具有重要意義。隨著人類基因組計(jì)劃的順利完成，生物信息數(shù)據(jù)的不斷積累與豐富，定位候選克隆策略成為發(fā)現(xiàn)疾病致病基因的重要方法。本研究根據(jù)口腔頜面部的發(fā)育規(guī)律，運(yùn)用現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)從下頜骨發(fā)育的易感區(qū)域——D10Mit70和D10Mit136間、D11Mit152和Hba間、D11Mit229和D11Mit163間篩選出包括OTX1在內(nèi)的12個(gè)可能的候選基因。經(jīng)過(guò)編碼蛋白質(zhì)序列性質(zhì)、功能分析最后選用OTX1進(jìn)行后續(xù)研究。OTX1基因是定位于2p13，含有5個(gè)外顯子，編碼354個(gè)氨基酸，廣泛分布在骨、神經(jīng)系統(tǒng)、眼、消化道、肺、卵巢、胰腺等組織，在胎兒、胚胎性組織及干細(xì)胞中也有表達(dá)［7，8］。文獻(xiàn)證實(shí)它是脊椎動(dòng)物大腦發(fā)育中至關(guān)重要的調(diào)控因子，對(duì)皮層的發(fā)育、結(jié)構(gòu)構(gòu)建、細(xì)胞增殖等起關(guān)鍵調(diào)控作用，還和下頜、眼、耳等發(fā)育密切相關(guān)［9］。但OTX1與遺傳性骨性反頜的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。

隨著第3代遺傳標(biāo)記SNP的廣泛確認(rèn)，其與疾病的關(guān)聯(lián)研究顯示出廣闊的應(yīng)用前景。SNP具有以下不可比擬的優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量多，分布廣泛；具有遺傳穩(wěn)定性；易于基因分型；位于基因編碼區(qū)的cSNP（coding region SNP）可代表改變遺傳機(jī)制的候選基因；適于快速、高通量檢出。DNA測(cè)序是檢測(cè)SNP的傳統(tǒng)方法，具有自動(dòng)化、高通量的特點(diǎn)，可以檢出不確知位點(diǎn)的SNP位置和類型。本研究以O(shè)TX1SNP作為遺傳標(biāo)記，利用PCR擴(kuò)增后直接測(cè)序的方法篩查了具有家族遺傳傾向的骨性反牙合畸形患者中該基因的編碼區(qū)突變和SNP多態(tài)位點(diǎn)的分布情況，并進(jìn)行位點(diǎn)連鎖不平衡檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，OTX1基因全部外顯子未發(fā)現(xiàn)任何突變，在第5外顯子處發(fā)現(xiàn)了1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，經(jīng)與EST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確認(rèn)該多態(tài)位點(diǎn)為rs17850223。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，病例組和正常對(duì)照組該位點(diǎn)基因型頻率的期望值與觀察值吻合度良好，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明遺傳符合孟德?tīng)柖?，抽樣和分組結(jié)果可信。病例組CG基因型頻率為36.85%，高于對(duì)照組的17.00%，二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs6179位點(diǎn)是一種同義SNP，其密碼子的第3核苷酸發(fā)生了G/C轉(zhuǎn)換，但編碼序列改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，仍編碼亮氨酸。遺傳標(biāo)記位點(diǎn)和疾病關(guān)聯(lián)的現(xiàn)象可歸納為2種情況：一種是遺傳標(biāo)記本身與疾病的病理發(fā)生有關(guān)，另一種是致病位點(diǎn)與遺傳標(biāo)記位點(diǎn)存在很強(qiáng)的連鎖不平衡。由此推測(cè)rs17850223位點(diǎn)可能與疾病的病理發(fā)生無(wú)關(guān)，而是與某一致病基因位點(diǎn)存在很強(qiáng)的連鎖不平衡。經(jīng)SNP的傳遞不平衡檢驗(yàn)，初步證實(shí)了OTX1基因可能是遺傳性骨性反牙合的易感基因，但關(guān)于rs17850223多態(tài)位點(diǎn)與遺傳性骨性反牙合的連鎖分析還應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，采用核心家系加以驗(yàn)證。

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