龔信芳，李平，梁磊，朱明軍

1(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州，510006)2(廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣東廣州，510316)

木薯渣分批補(bǔ)料酶水解及酒精發(fā)酵的研究*

龔信芳1，李平1，梁磊2，朱明軍1

1(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州，510006)2(廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣東廣州，510316)

木薯渣是木薯淀粉加工后的廢棄物，碳水化合物含量高。實(shí)驗(yàn)利用復(fù)合酶對(duì)木薯渣中淀粉和纖維素等碳水化合物非熱水解進(jìn)行了探索，結(jié)果表明:木薯渣具有較好的酶解性能;隨著底物濃度的增大，酶解液糖濃度也不斷提高，酶解得率逐漸降低;與間歇糖化工藝相比，16%底物在相同的水解條件和相同的酶添加量的條件下，采用4%的起始底物濃度，每隔12 h進(jìn)行補(bǔ)料，葡萄糖得率從53.6%提高到72.4%;以不添加任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的水解液為原料進(jìn)行酒精發(fā)酵，24h乙醇濃度達(dá)到24.9 g/L，乙醇得率達(dá)到42%，發(fā)酵效率為82%，乙醇產(chǎn)率達(dá)到1.04 g/(L·h)，葡萄糖利用率達(dá)到97%。

木薯渣，復(fù)合酶，分批補(bǔ)料糖化，酒精發(fā)酵

木薯是世界三大薯類之一，產(chǎn)于熱帶地區(qū)，在我國(guó)主要分步在廣西、廣東和福建等地。木薯渣是生產(chǎn)木薯淀粉所剩下的固體廢料，其淀粉含量較高，同時(shí)也含有一定量的木質(zhì)纖維素，極易變質(zhì)腐化。

目前有很多研究人員對(duì)利用其作飼料進(jìn)行了研究，但未見有實(shí)現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化利用的報(bào)道［1－2］。也有研究將木薯渣與淀粉生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的黃漿水混合生產(chǎn)酒精，但該方法得到的發(fā)酵成熟醪中酒精含量較低，生產(chǎn)的設(shè)備利用率、勞動(dòng)生產(chǎn)率低并且能耗高，也未能大規(guī)模推廣。很多企業(yè)目前產(chǎn)生的木薯渣仍然是作為廢棄物，造成資源的巨大浪費(fèi)。因此，如何有效地利用木薯渣仍然是木薯淀粉企業(yè)面臨的難題。

Ukrit等［3］對(duì)利用果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶多種酶水解木薯渣進(jìn)行了研究，開發(fā)了木薯渣的低溫水解工藝，但最終乙醇發(fā)酵濃度只有14.3 g/L。林武滔等［4］對(duì)木薯渣預(yù)處理和間歇酶解工藝進(jìn)行了研究，酶用量達(dá)到120 FPU/g底物，而且葡萄糖濃度較低。

如何將木薯渣高效水解成高濃度的還原糖是木薯渣應(yīng)用的關(guān)鍵。本研究擬開發(fā)木薯渣分批補(bǔ)料酶水解工藝，利用淀粉酶、糖化酶、纖維素酶和纖維二糖水解酶等混合酶將木薯渣中淀粉和纖維素等碳水化合物進(jìn)行非熱水解，比較不同pH、溫度、底物濃度和水解工藝的影響，以提高水解液糖濃度和酶水解得率，從而提高乙醇發(fā)酵濃度。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 木薯渣

來自廣西武鳴安寧淀粉責(zé)任有限公司，50℃烘至恒重，粉碎機(jī)粉碎過40目篩，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 淀粉酶溶液

諾維信α-淀粉酶，廣西某淀粉廠贈(zèng)送。取淀粉酶原液1.0 mL，用pH 6.0檸檬酸緩沖液定容至100 mL，此時(shí)酶活為2 000 IU/mL。淀粉酶最適溫度為90～100℃，最適合pH值為5.0～6.0。

1.1.3 糖化酶溶液

購(gòu)自廣州齊云生物技術(shù)有限公司。稱取固體糖化酶0.5 g，用pH 5.0檸檬酸緩沖液定容至100 mL，此時(shí)酶活為500IU/mL。糖化酶最適溫度為55～60℃，最適合pH值為4.0～5.0。

1.1.4 纖維素酶

Spezyme CP(Genencor)。酶活為13FPU/mL。纖維素酶最適溫度為50～55℃，最適合pH值為5.0。

1.1.5 β-葡萄糖苷酶

NovozymeTM188(Sigma-Aldrich Co.)。酶活為100IU/mL。β－葡萄糖苷酶最適溫度為50℃，最適合pH值為4.8～5.0。

1.2 方法

1.2.1 木薯渣成分測(cè)定

淀粉測(cè)定:《GB－T 5514－2008糧油檢驗(yàn) 糧食、油料中淀粉含量測(cè)定》。

半纖維素、纖維素、木質(zhì)素含量測(cè)定通過硫酸兩步水解測(cè)定;酸溶性木質(zhì)素與酸不溶性木質(zhì)素通過紫外檢測(cè)(UV)和質(zhì)量差來測(cè)定［5］。

灰分測(cè)定:《GB 5009.4－2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》。

1.2.2 酶水解液中還原糖及發(fā)酵產(chǎn)物的測(cè)定

水解液中還原糖包括葡萄糖和木糖，采用Waters1525 LC(Millford，LA)測(cè)定相應(yīng)含量［5］。

1.3 酶水解

木薯渣采用四種酶進(jìn)行水解［3］，分別為淀粉酶、糖化酶、Spezyme CP(Genencor Inc.)和 NovozymeTM188(Sigma-Aldrich Co.)。

木薯渣水混合物呈酸性懸浮液，因此，水解前需用堿進(jìn)行中和。初始底物濃度4%(w/v，以總的碳水化合物的濃度來表示)，工作體積50mL，在121℃下滅菌30min，待木薯渣水混合物冷卻至40℃左右加入已過濾除菌的酶溶液，在不同 pH 值(3，4，5，6，7)，不同溫度(40，50，60，70，80℃)，置于 200 r/min 搖床中進(jìn)行水解反應(yīng)。

水解反應(yīng)在100 mL血清瓶中進(jìn)行，工作體積為50 mL。水解結(jié)束后，將水解液離心，5000 g，20 min，分離上清液和未水解的木薯渣，上清液用于后續(xù)發(fā)酵，木薯渣水解產(chǎn)物及相應(yīng)含量通過HPLC測(cè)定。

分批補(bǔ)料即將底物等分后分多次加入進(jìn)行酶解，酶解條件和處理方法相同。

1.4 菌種與種子液的制備

用于此研究工作的酒精酵母SHY08－3(Saccharomyces cerevisiae)由華南理工大學(xué)發(fā)酵工程研究室保存。

斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母粉 10，蛋白胨 5，瓊脂 15。115℃滅菌20min。

種子液的制備:250 mL三角瓶中裝入50 mL無菌培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基的成分同斜面培養(yǎng)基，不加瓊脂，115℃滅菌20 min。)，從種子斜面接2環(huán)酒精酵母后于30℃，200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)入50 mL無菌離心管中5 000 r/min離心5 min，傾出上清液，用無菌生理鹽水洗滌1次，離心5 min(5 000 r/min)棄上清液，加入3mL無菌生理鹽水，混勻作為種子液。種子液的菌濃約為4×108個(gè)/mL。

1.5 水解液的酒精發(fā)酵

于100 mL血清瓶中加入47 mL水解液，115℃滅菌20 min，無菌接入種子培養(yǎng)液，使發(fā)酵液總體積為50 mL，蓋上橡膠塞后用鋁蓋保壓，選擇37℃和200 r/min進(jìn)行發(fā)酵，每隔4～12h取樣。樣品于12 000 r/min離心5 min，將離心后上清液按5%(v/v)加入10%(v/v)的 H2SO4后，0.22μm 膜過濾，HPLC分析樣品成分。

1.6 酶水解和乙醇發(fā)酵的計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯渣(干重)成分分析

木薯渣的主要成分(見表1)與國(guó)外的一些文獻(xiàn)報(bào)道的成分含量有差異，特別是淀粉含量低于有些文獻(xiàn)報(bào)道值［6］。但是該木薯渣中總碳水化合物含量比較高，灰分含量低，因此有利于各種酶將其中的碳水化合物轉(zhuǎn)化為能被利用的還原糖。

表1 木薯渣主要成分含量(干重)

2.2 不同pH對(duì)木薯渣酶解的影響

酶的催化作用與反應(yīng)液的pH值有很大關(guān)系。每一種酶都有其各自的適宜pH值范圍和最適pH值。只有在適宜pH值范圍內(nèi)，酶才能顯示其催化活性;在最適pH值條件下，酶催化反應(yīng)速度達(dá)到最大。pH值過高或過低，都會(huì)影響酶的活性，因此，在酶催化反應(yīng)過程中，必須控制好pH值［7］。取2 g粉碎后的木薯渣(其淀粉和纖維素含量為51.52%)置于血清瓶，工作體積為50 mL，此時(shí)固形物含量為4%。用20 g/L NaOH 溶液調(diào) pH 分別為 3、4、5、6、7，在無菌情況下加入淀粉酶500 IU/g淀粉、糖化酶500IU/g淀粉、纖維素酶 15FPU/g纖維素、β-葡萄糖苷酶30U/g纖維素。維持溫度50℃、轉(zhuǎn)速200 r/min開始水解。在不同的時(shí)間段取樣，采用HPLC檢測(cè)分析水解液組分。72 h水解結(jié)束，取樣并進(jìn)行殘余含量測(cè)定。由圖1可知，在底物濃度為4%時(shí)，pH值5的情況下，葡萄糖得率達(dá)到 74.4%，木糖得率達(dá)到38.9%。當(dāng)pH增大到8時(shí)，酶解得率迅速下降，可以看出，此時(shí)酶失活的比較嚴(yán)重，均超出了酶適宜范圍。

圖1 不同pH對(duì)木薯渣酶解得率的影響

2.3 不同溫度對(duì)木薯渣酶解的影響

溫度主要影響酶的穩(wěn)定程度，即酶的熱變性。一般來說，酶促反應(yīng)在一定溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)速度隨著反應(yīng)溫度的升高而加快;溫度降低，則反應(yīng)速度下降，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)。但溫度超過某一界限，蛋白質(zhì)會(huì)變性，即酶的活性降低甚至失活。除溫度不同外，其它所用一切如原料和試劑等均與2.2相同。結(jié)果表明(圖2)，40～100℃試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，最適溫度在50℃。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，酶解得率繼續(xù)下降。溫度上升到90℃，木糖得率幾乎為0，可以看出，此時(shí)纖維素酶已經(jīng)失活，而淀粉酶是耐高溫酶，因此還存在一定的葡萄糖得率。

圖2 不同溫度對(duì)木薯渣酶解得率的影響

2.4 分批補(bǔ)料對(duì)木薯渣酶解的影響

從表2中可以看出，隨著底物濃度的不斷增加，葡萄糖得率和木糖得率不斷降低，分別從8%時(shí)的72.9%和38.3%降低為16%時(shí)的53.6%和33.4%。在底物濃度為8%時(shí)，一次補(bǔ)料與分批補(bǔ)料沒有太大區(qū)別，葡萄糖得率都保持在70%以上;而在較高底物濃度時(shí)，分批補(bǔ)料與一次補(bǔ)料的酶解得率差距不斷增大。在底物濃度為16%時(shí)，分批補(bǔ)料的葡萄糖得率比一次補(bǔ)料葡萄糖得率要高出18.8%，分批補(bǔ)料酶解可以同時(shí)提高還原糖得率和酶解液中還原糖濃度。

表2 間歇和分批補(bǔ)料的木薯渣酶解結(jié)果比較

2.5 補(bǔ)料時(shí)間間隔對(duì)木薯渣酶解的影響

分批補(bǔ)料中一個(gè)重要的因素是補(bǔ)料時(shí)間間隔，它與酶水解程度和水解速率有密接的聯(lián)系。如果水解時(shí)間太短，水解不完全，補(bǔ)料會(huì)影響酶液擴(kuò)散;如果時(shí)間間隔較大，拉長(zhǎng)了整體水解時(shí)間，不利于保持酶的活性。本研究選取3個(gè)時(shí)間間隔做比較。對(duì)比時(shí)間間隔分別為6、12與24 h時(shí)的分批補(bǔ)料酶水解情況，在反應(yīng)終點(diǎn)測(cè)定酶解的葡萄糖和木糖含量并計(jì)算其得率，結(jié)果見圖3。

圖3 不同時(shí)間間隔分批補(bǔ)料的酶解得率

從圖3中可以看出，間隔12h的分批補(bǔ)料明顯要比間隔6h與間隔24h的分批補(bǔ)料操作的酶解效率更高，葡萄糖得率達(dá)到80%，而間隔6 h與24 h的2種分批補(bǔ)料操作的得率不相上下。推測(cè)這可能與酶解程度及酶的穩(wěn)定性有關(guān)。12h內(nèi)，淀粉酶與纖維素酶使固形物含量迅速下降，此時(shí)補(bǔ)料，緩解了固形物濃度對(duì)酶的傳質(zhì)阻力，在酶解速率高的情況下補(bǔ)料有利于提高酶解效率［9］。

2.6 不同工藝對(duì)木薯渣酶解影響

研究中還發(fā)現(xiàn)，不同的工藝流程也會(huì)對(duì)酶解得率有影響。酶分步加入能夠緩解各種酶之間的抑制作用，酶分批加入能夠適當(dāng)保證酶活的穩(wěn)定［10］，分批補(bǔ)料能夠緩解底物濃度對(duì)酶作用的抑制。在溫度和轉(zhuǎn)速相同的條件下，從圖4可以看出在底物濃度16%時(shí)，4種不同的工藝流程的酶解得率依次遞增。

圖4 不同過程工藝對(duì)酶解得率的影響

本研究中另一種工藝流程——酶分批加入的葡萄糖得率得率也高于一次加入的葡萄糖得率，達(dá)到61.2%，而分批補(bǔ)料的葡萄糖得率和木糖得率達(dá)到最大，達(dá)到72.4%和39.6%。

2.7 木薯渣水解液的乙醇發(fā)酵

以16%固形物含量的分批補(bǔ)料酶解過程后得到的水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度為37℃，自然pH(實(shí)測(cè)為4.8)，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min的培養(yǎng)條件下發(fā)酵48 h，底物消耗和產(chǎn)物生成變化如到圖5所示。

圖5 木薯渣水解液的乙醇發(fā)酵時(shí)間曲線

由圖5可以看出，水解液在不補(bǔ)加任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的情況下能夠很好地被酵母利用，葡萄糖濃在12h內(nèi)迅速被消耗，至發(fā)酵24h，水解液中的葡萄糖還剩下2 g/L。此時(shí)，乙醇濃度達(dá)到24.9 g/L，水解液的乙醇得率為42%，發(fā)酵效率為82%。從分析結(jié)果可以看出，利用木薯渣水解液發(fā)酵，其葡萄糖利用率達(dá)到97%?？梢姡臼碓庖簩?duì)酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響較小。

3 結(jié)論

(1)木薯渣具有較好的酶解性能，采用非熱酶解具有可行性。

(2)隨著底物濃度的增大，酶解液糖濃度也不斷提高，然而其酶解得率逐漸降低。

(3)以分批補(bǔ)料的形式進(jìn)行木薯渣的酶水解，可以減小酶解過程中因底物濃度過高而產(chǎn)生的對(duì)酶解反應(yīng)的抑制，促進(jìn)酶解反應(yīng)的進(jìn)行。采用4%的起始底物濃度，每隔12h進(jìn)行補(bǔ)料，在底物濃度提高至16%時(shí)，葡萄糖得率從53.6%提高到72.4%。此時(shí)，水解液中的還原糖濃度提高至65.7 g/L。

(4)以16%固形物含量的分批補(bǔ)料過程后得到的水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行乙醇發(fā)酵，葡萄糖利用率達(dá)到97%，乙醇濃度達(dá)到24.9 g/L，乙醇得率為42%，發(fā)酵效率為82%，乙醇產(chǎn)率達(dá)到1.04 g/(L·h)。

［1］ 劉平.木薯渣飼料資源化開發(fā)研究［J］.飼料與營(yíng)養(yǎng)，2009(1):55－59.

［2］ 郝靜，劉鋼，左福元.木薯渣的飼用價(jià)值及應(yīng)用［J］.飼料研究，2007(11):64－66.

［3］ Ukrit Rattanachomsri，Sutipa Tanapongpipat，et al.Simultaneous non－thermal saccharification of cassava pulp by multi－enzyme activity and ethanol fermentation by Candida tropicalis［J］.Bioscience and Bioengineering，2009，107(5):488－492.

［4］ 林武滔，陳啟杰，羅菊香，等.木薯渣預(yù)處理工藝和酶水解工藝研究［J］.新鄉(xiāng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，26(6):39 －42.

［5］ 江丹，李旭暉，朱明軍.造紙污泥同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(11):32－35.

［6］ Akihiko Kosugi，Akihiko Kondo，et al.Production of ethanol from cassava pulp via fermentation with a surface-engineered yeast strain displaying glucoamylase［J］.Renewable Energy，2009(34):1 154 －1 158.

［7］ 郭勇.酶工程(第二版)［M］.北京:科學(xué)出版社，2004:6－8.

［8］ 陳洪章，李佐虎.影響纖維素酶解的因素和纖維素酶被吸附性能的研究［J］.化學(xué)反應(yīng)工程與工藝，2000，16(1):32－35.

［9］ 劉超綱，劉力，余世袁.分批添料纖維素酶水解研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，1996，16(1):58 －62.

［10］ 賈樹彪，李盛賢，吳國(guó)峰，等.新編酒精工藝學(xué)(第二版)［M］.化學(xué)工業(yè)出版社，2009:26－27.

Investigation on the Fed-batch Hydrolysis of Cassava Pulp by Multi-Enzyme and Ethanol Fermentation by Saccharomyces cerevisiae

Gong Xin-fang1，Li Ping1，Liang Lei2，Zhu Ming-jun1
1(School of Bioscience ＆ Biotechnology，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China)2(Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute，Guangzhou 510316，China)

Cassava pulp，which has high carbohydrate content，is the waste of cassava starch processing.Nonthermal hydrolysis of cassava pulp by multi-enzyme and different operation procedures were studied.The results showed that the conversion rate of cassava pulp to glucose with fed-batch hydrolysis increased from 53.6%to 72.4%compared with the batch process.The hydrolysate was able to be used for ethanol fermentation without any nutrition supplementation and ethanol concentration reached 24.9 g/L and glucose utilization rate reached 97%at 24 h，as well as ethanol yield 42%，fermentation efficiency 82%and ethanol productivity 1.04 g/(L·h).

cassava pulp，multi-enzyme，fed-batch hydrolysis，ethanol fermentation

碩士研究生(朱明軍副教授為通訊作者，E-mail:mjzhu@scut.edu.cn)。

*國(guó)家自然科學(xué)基金(51078147)和廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010B031700022和2010A010500005)資助

2010－11－09，改回日期:2011－03－07