張智錦 胡建平

摘要：完整而確定的ＨＩＶ－１整合酶結(jié)構(gòu)在基于受體的抗ＡＩＤＳ藥物設(shè)計中起著重要的作用。概述了ＨＩＶ－１整合酶的結(jié)構(gòu)和功能，并從片段結(jié)構(gòu)、模建的全長聚集體以及同源體系３個方面綜述了整合酶結(jié)構(gòu)的研究進展。給出了各個代表性體系的應(yīng)用價值。旨在對ＨＩＶ－１整合酶抑制劑藥物設(shè)計及篩選平臺的建立提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：ＨＩＶ－１；整合酶；結(jié)構(gòu)；藥物設(shè)計

中圖分類號：Ｑ８１４；Ｏ６４１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）15－3032-06

Research Advances on the Structure of HIV-1 Integrase

ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ－ｊｉｎ，ＨＵ Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｕｎｔ Ｅｍｅｉ， Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｌｅｓｈａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，

Ｌｅｓｈａｎ ６１４００４， Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ＨＩＶ－１ （Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １） ｉｎｔｅｇｒａｓｅ ｐｌａｙｓ ｋｅｙ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＡＩＤＳ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｃｃｅｐｔｏｒ． Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｉｎｔｅｇｒａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ａｓｐｅｃｔｓ， ｓｅｇｍｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ， ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｍｕｌｔｉｍｅｒ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ， ｗｅｒｅ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ ｏｆ each ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ evaluated ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｓｏｍｅ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ platform ｅｓｔａｂｌｉｓｈed ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ screening ｏｆ ＨＩＶ－１ ｉｎｔｅｇｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＨＩＶ－１； ｉｎｔｅｇｒａｓｅ； ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ； ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ

自從１９８１年６月發(fā)現(xiàn)首例艾滋病患者以來，艾滋病在全球范圍內(nèi)迅速傳播。艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合癥（Ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）。中國大陸在１９８５年發(fā)現(xiàn)首例ＡＩＤＳ，ＡＩＤＳ在我國的流行經(jīng)歷了傳入期、播散期，目前正處于高速發(fā)展期。根據(jù)最近世界衛(wèi)生組織（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ＷＨＯ）和聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署（ＵＮＡＩＤＳ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎａｉｄｓ．ｏｒｇ）的估算，截至２００９年底，全球ＡＩＤＳ感染者已達３ ５００萬人，其中成年人超過３ ０００萬人，婦女和兒童超過１ ９００萬人。我國ＡＩＤＳ病毒感染者總數(shù)已接近１００萬人，并呈上升趨勢，若不能有效控制，今后１０年這一數(shù)字可能會成倍增長，形勢十分嚴峻。ＡＩＤＳ已成為威脅人類健康的大敵，對社會將造成巨大破壞。

Ｉ型人類免疫缺陷病毒（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １，ＨＩＶ－１）是引起ＡＩＤＳ的病源?；颊唧w內(nèi)ＨＩＶ－１致死ＣＤ４＋細胞，干擾其正常功能，使患者免疫功能減弱，進而引發(fā)ＡＩＤＳ。當前ＡＩＤＳ治療的主要策略是聯(lián)合使用逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（Ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ－ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ， ＨＡＡＲＴ），又稱“雞尾酒療法”。盡管該策略在ＡＩＤＳ治療上發(fā)揮了重要作用，但兩類抑制劑存在較大的抗藥性、高毒性及高價格。臨床上迫切需要尋找新的抗ＡＩＤＳ藥物靶點［１，２］。ＨＩＶ－１整合酶（Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ， ＩＮ）能介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒ＤＮＡ整合到宿主細胞ＤＮＡ中，整合過程包括兩步反應(yīng)［３］： 第一步是３端加工（３－ｅｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， ３ＥＰ），即ＩＮ切割并結(jié)合病毒ＤＮＡ形成ＩＮ－病毒ＤＮＡ復(fù)合物；第二步是鏈轉(zhuǎn)移（Ｓｔｒａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ， ＳＴ），即ＩＮ－病毒ＤＮＡ復(fù)合物切割并結(jié)合宿主細胞ＤＮＡ，將病毒ＤＮＡ整合到宿主ＤＮＡ中，并隨著宿主ＤＮＡ的復(fù)制而復(fù)制。如果能抑制病毒ＤＮＡ的整合過程，就防止了細胞被永久性的感染，而且人體細胞中沒有ＩＮ的功能類似物，使得ＩＮ抑制劑選擇性很高，對于正常細胞毒性小，所以針對ＩＮ催化反應(yīng)的抑制劑設(shè)計已經(jīng)成為國際上抗ＡＩＤＳ藥物研究的熱點［４－６］。２００７年 Ｒａｌｔｅｇｒａｖｉｒ（ＭＫ２０５１８）被批準為第一個抑制ＩＮ的新藥，ＩＮ抑制劑的研究取得了重大突破［７，８］。

ＨＩＶ－１ ＩＮ含２８８個氨基酸殘基，大小為３２ kD，由Ｎ－端結(jié)構(gòu)域（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ， ＮＴＤ）催化核心結(jié)構(gòu)域（Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃｏｒｅ ｄｏｍａｉｎ，ＣＣＤ）和Ｃ－端結(jié)構(gòu)域（Ｃ－ｔｅｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ， ＣＴＤ）折疊而成。ＮＴＤ是由１～４９位氨基酸殘基組成的螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋結(jié)構(gòu)，內(nèi)含一個不保守的ＨＨＣＣ鋅指結(jié)構(gòu)，功能上主要是促進酶的四聚化和增強酶的催化活性［９］。ＣＣＤ由５０～２１２位氨基酸殘基組成，含有混合的α／β結(jié)構(gòu)（共５個β折疊和６個α螺旋），是ＩＮ參與催化反應(yīng)的主要區(qū)域，含有核酸內(nèi)切酶和聚核苷酸轉(zhuǎn)移酶的酶切位點。ＣＣＤ結(jié)構(gòu)上有高度保守的ＤＤＥ酸性基序與二價金屬離子（Ｍｎ２＋或Ｍｇ２＋），二者螯合共同構(gòu)成ＩＮ的活性中心。值得一提的是，這３個酸性關(guān)鍵殘基分別分布在不同的結(jié)構(gòu)段上，即β１無規(guī)卷曲和α４段。另外，殘基范圍１４０～１４９的二級結(jié)構(gòu)是一個較長的無規(guī)卷曲，該區(qū)域結(jié)構(gòu)的充分柔性對于ＩＮ的催化是必須的［１０］。ＣＴＤ由２１３～２８８位氨基酸殘基組成，包含了５個反平行的β折疊，形成了一個β桶，在ＩＮ的３個結(jié)構(gòu)域中保守性最小，功能上是參與結(jié)合非特異性ＤＮＡ，穩(wěn)定ＩＮ－ＤＮＡ復(fù)合物結(jié)構(gòu)［１１］。一般認為，單獨的ＣＣＤ就能進行簡單的去整合反應(yīng)，但是要完全實現(xiàn)３ＥＰ和ＳＴ反應(yīng)，３個結(jié)構(gòu)域缺一不可［１２］。

近年來，ＨＩＶ－１ ＩＮ結(jié)構(gòu)的研究是一個熱點問題，引起了很多研究者的重視。有生物學(xué)家已經(jīng)從蛋白質(zhì)結(jié)晶以及突變試驗等方面對ＩＮ的結(jié)構(gòu)及催化功能進行了較為全面的研究，并取得了一定的成果。分子模擬理論工作者則主要用結(jié)構(gòu)模建、分子對接以及虛擬篩選等方面進行了一些較為系統(tǒng)的研究。筆者從片段結(jié)構(gòu)、聚集體模建和同源復(fù)合物體系的角度出發(fā)，將ＨＩＶ－１ ＩＮ結(jié)構(gòu)的最新研究進展進行了綜述， 旨在為有效設(shè)計ＨＩＶ－１ ＩＮ抑制劑提供參考。

１整合酶的片段結(jié)構(gòu)

由于ＨＩＶ－１ ＩＮ溶解性較差，難以穩(wěn)定結(jié)晶，迄今生物學(xué)家用Ｘ－ｒａｙ和ＮＭＲ試驗方法仍未獲得完整的ＩＮ單體結(jié)構(gòu)，更不用說二聚體和四聚體。但蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｎｋ， ＰＤＢ）中目前已經(jīng)有超過２５個ＨＩＶ－１ ＩＮ的片段結(jié)構(gòu)。這里將綜述比較有代表性的ＨＩＶ－１ ＩＮ片段結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)雖然僅是ＩＮ的片段結(jié)構(gòu)，但是它們對于早期的科研以及全長ＩＮ模建中起著重要的作用［１３，１４］。

前面提到，作為聚核苷酸轉(zhuǎn)移酶，ＨＩＶ－１ ＩＮ含有２個金屬結(jié)合區(qū)域，即結(jié)合Ｚｎ２＋的ＮＴＤ鋅指結(jié)構(gòu)和結(jié)合Ｍｇ２＋或Ｍｎ２＋的ＣＣＤ，這些金屬離子是酶催化所必須的。Ｂｕｊａｃｚ等［１５］用Ｘ－ｒａｙ試驗首次獲得了含雙Ｍｇ２＋的ＣＣＤ晶體結(jié)構(gòu)（ｐｄｂ代碼：１ＶＳＨ）。圖１（Ａ）給出了１ＶＳＨ三維結(jié)構(gòu)，其中用綠色Ｓｏｌｉｄ ｒｉｂｂｏｎ模式表示蛋白質(zhì)部分，金屬離子用黑色ＣＰＫ模式表達，而ＤＤＥ基序（Ａｓｐ６４，Ａｓｐ１２１和Ｇｌｕ１５７）殘基用粉紅色Ｓｔｉｃｋ表示。該結(jié)構(gòu)的解析首先證明了ＩＮ催化中需要雙金屬參與的觀點一致，另外，Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋以及Ｃｄ２＋均可以結(jié)合到ＣＣＤ活性口袋區(qū)中。試驗還表明，功能Lｏｏｐ區(qū)（殘基１３８～１４９）的柔性是整合酶維持高活性所必須的。由于有Ｍｇ２＋位置的確定，將為后續(xù)的結(jié)構(gòu)解析提供了較好的參照作用。Ｇｏｌｄｇｕｒ等［１６］通過雙突變Ｆ１８５Ｋ和Ｗ１３１Ｅ提高ＩＮ的溶解度，并把雙突變ＩＮ在大腸桿菌中表達出來，然后用Ｘ－ｒａｙ方法獲得了到目前為止惟一的一個ＩＮ與其抑制劑１－（５－氯－吲哚－３－甲酸）－３－四唑基－１，３－丙二酮烯醇（５ＣＩＴＥＰ）的復(fù)合物結(jié)構(gòu)（ｐｄｂ代碼：１ＱＳ４），分辨率是２．１?魡。值得一提的是，ＩＮ部分由３個ＣＣＤ組成。圖１（Ｂ）給出了１ＱＳ４中一個單體的三維結(jié)構(gòu)，其中蛋白質(zhì)和金屬離子表示方法同圖１（Ａ），而ＤＤＥ基序（Ａｓｐ６４， Ａｓｐ１１６和Ｇｌｕ１５２）殘基和５ＣＩＴＥＰ抑制劑分別用黃色Ｓｔｉｃｋ以及粉紅色Ｂａｌｌ－ａｎｄ－ｓｔｉｃｋ表示。１ＱＳ４中Ｍｇ２＋、ＤＤＥ基序和抑制劑５ＣＩＴＥＰ高分辨率的結(jié)合模式，為后續(xù)基于ＩＮ結(jié)構(gòu)的藥物分子設(shè)計提供了有用結(jié)構(gòu)信息。

多位點突變策略較大地提高了ＨＩＶ－１ ＩＮ的溶解性，解析所得片段也逐漸變長。Ｃｈｅｎ等［１７］通過引入五點突變（Ｃ５６Ｓ／Ｗ１３１Ｄ／Ｆ１３９Ｄ／Ｆ１８５Ｋ／Ｃ１８０Ｓ），首次解析出包含有ＣＣＤ和ＣＴＤ區(qū)域的ＨＩＶ－１ ＩＮ片段的對稱二聚體，分子外形是一個“Ｙ”字形，殘基范圍是５２～２８８，分辨率為２．８?魡（ｐｄｂ代碼：１ＥＸ４），結(jié)構(gòu)詳見圖１（Ｃ）。ＣＣＤ和ＣＴＤ之間靠２７個氨基酸長度的α６螺旋（殘基１９５～２１１）連接?？梢酝茰y，兩個較長的α６柔性臂可能在整合催化中起著結(jié)構(gòu)域重定向作用。值得一提的是，該結(jié)構(gòu)是首次報道的多結(jié)構(gòu)域ＩＮ體系，從結(jié)構(gòu)上解釋了ＩＮ四聚體存在的合理性。兩個ＣＣＤ間存在１個二體接觸面，而兩個ＣＴＤ之間距離大約為５５?魡。試驗表明，ＣＴＤ有專一性結(jié)合ＤＮＡ的特性，推測ＣＴＤ在整合催化作用中，應(yīng)該有參與結(jié)合、彎轉(zhuǎn)甚至重定向病毒ＤＮＡ的功能。電勢計算結(jié)果表明，ＩＮ二聚體中有一條沿Ｂ鏈ＣＣＤ到Ａ鏈ＣＴＤ的狹長正電區(qū)域帶，病毒ＤＮＡ可能結(jié)合到該區(qū)域。參與結(jié)合的氨基酸殘基有Ｂ鏈的Ｌｙｓ１５９、Ｌｙｓ１８６、Ａｒｇ１８７和Ｌｙｓ１８８以及Ａ鏈的Ｌｙｓ２１１、Ｌｙｓ２１５、Ｌｙｓ２１９、Ｌｙｓ２４３、Ａｒｇ２６３和Ａｒｇ２６４，這點證明了結(jié)構(gòu)完整性是ＩＮ發(fā)揮其催化功能的基礎(chǔ)。另外該課題組還解析一個單獨ＣＣＤ（殘基范圍５２~２１２）結(jié)構(gòu)，與１ＥＸ４的ＣＣＤ部分完全吻合，進一步證明了１ＥＸ４結(jié)構(gòu)的合理性。Ｗａｎｇ等［１８］解析出了包含有ＮＴＤ和ＣＣＤ區(qū)域的ＨＩＶ－１ ＩＮ片段結(jié)構(gòu)（ｐｄｂ代碼：１Ｋ６Ｙ），形成了１對非對稱的ＩＮ四聚體，ＣＣＤ和ＣＴＤ之間是靠一個高度無序鏈４７～５５連接，殘基范圍是１～２１２，結(jié)構(gòu)詳見圖１（Ｄ）。該結(jié)構(gòu)給出了ＩＮ四聚體中ＮＴＤ以及ＣＣＤ的接觸界面，是模建ＩＮ四聚體的基本模板，具體做法是與包含有ＣＣＤ和ＣＴＤ區(qū)域的片段疊合，結(jié)構(gòu)衍生模建出全長的ＨＩＶ－１ ＩＮ二聚體和四聚體。為了提高溶解性以利于結(jié)晶，體系進行了三位點突變（Ｗ１３１Ｄ／Ｆ１３９Ｄ／Ｆ１８５Ｋ）。結(jié)構(gòu)分析表明，１Ｋ６Ｙ每個ＣＣＤ或者ＣＴＤ與之前報道的單體三維結(jié)構(gòu)十分吻合，而且ＣＣＤ與１ＥＸ４的對應(yīng)區(qū)域結(jié)構(gòu)類似。

２完整聚集體模建研究

體內(nèi)及體外的一系列生物學(xué)試驗研究［１９］表明，有活性的ＨＩＶ－１ ＩＮ是多聚體，而且病毒中也存在一些低聚體ＩＮ，推測ＩＮ在多聚體和低聚體之間有一個動態(tài)平衡。但是ＩＮ活性多聚體亞基數(shù)目有待深入研究［２０］。基于ＰＤＢ庫中已有的ＩＮ片段結(jié)構(gòu)，國際上已有很多小組用同源模建方法獲得了全長ＩＮ二聚體和四聚體等結(jié)構(gòu)。

Ｌｕｃａ等［２１］首次用同源模建方法搭建了一條完整的ＨＩＶ－１ ＩＮ二聚體結(jié)構(gòu)，并用ＥＳＣＨＥＲ分子對接程序與一條含有２７ ｂｐ的病毒ＤＮＡ進行復(fù)合物預(yù)測，獲得了ＩＮ與病毒ＤＮＡ的結(jié)合模式（ｐｄｂ代碼：１ＷＫＮ）。圖２（Ａ）給出了１ＷＫＮ的三維結(jié)構(gòu)，綠色及紫色Ｓｏｌｉｄ ｒｉｂｂｏｎ模式表示ＩＮ的兩個單體，而病毒ＤＮＡ用黃色Rｉｎｇ表示。模建過程有５個步驟：①保留１ＱＳ４ 晶體結(jié)構(gòu)［１６］中Ａ、Ｂ鏈的ＣＣＤ，去除其中的配體、結(jié)晶水及Ｃ鏈，并把４ 個缺失殘基Ｉｌｅ１４１、Ｐｒｏ１４２、Ｔｙｒ１４３和Ａｓｎ１４４ 依據(jù)１ＢＩＳ［２２］中Ｂ鏈的同源區(qū)域補全；②把晶體結(jié)構(gòu)中兩個突變殘基Ｆ１５８Ｋ和Ｗ１３１Ｅ替換為天然殘基，得到的野生型ＣＣＤ二聚體的Ａ、Ｂ鏈分別包含一個Ｍｇ２＋；③按照包含雙金屬離子與ＨＩＶ－１ ＩＮ高度同源的鳥肉瘤病毒ＩＮ結(jié)構(gòu)１ＶＳＨ［１５］，將第二個Ｍｇ２＋放置于Ａ、Ｂ鏈相應(yīng)的位置；④把雙金屬ＩＮ２核心區(qū)與ＰＤＢ代碼為１ＥＸ４［１７］和１Ｋ６Ｙ［１８］的結(jié)構(gòu)依次疊落以獲得全長的ＩＮ２；⑤最后與１ＷＪＤ［２３］結(jié)構(gòu)疊落補全缺失的４７～５５ 號殘基。通過詳細的接觸殘基分析，證明了搭建的全長ＩＮ二聚體－病毒ＤＮＡ復(fù)合物準確驗證了一系列交叉偶聯(lián)和突變試驗。Ｌｕｃａ采用的病毒ＤＮＡ是已經(jīng)切除３末端２個核苷酸的。實際上，在生理狀態(tài)下，病毒ＤＮＡ先與ＩＮ結(jié)合后再發(fā)生３ＥＰ反應(yīng)，隨之ＩＮ和病毒ＤＮＡ的構(gòu)象將發(fā)生一定變化。所以３ＥＰ反應(yīng)前后的結(jié)合模式可能會有所不同，基于此，有學(xué)者也用Ｊａｃｋａｌ程序搭建了全長的ＩＮ二聚體［２４－２６］。并用Ａｕｔｏｄｏｃｋ程序獲得了與８ ｂｐ以及２７ ｂｐ病毒ＤＮＡ（沒有切除ＣＡ堿基）的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)隨著病毒ＤＮＡ長度的增加，ＨＩＶ－１ ＩＮ２與病毒ＤＮＡ的具有生物活性的結(jié)合模式出現(xiàn)的可能性相應(yīng)增大。并用分子動力學(xué)方法研究了復(fù)合物在水溶液中的構(gòu)象變化。結(jié)果表明，與未結(jié)合ＩＮ的病毒ＤＮＡ相比，復(fù)合物中病毒ＤＮＡ的結(jié)合區(qū)堿基構(gòu)象變化較大，尤其是結(jié)合部位的小溝變寬。

最近，Ｗｉｅｌｅｎｓ等［２７］以及美國國家癌癥研究中心Ｋａｒｋｉ等［２８］分別用同源模建的方法獲得了全長的整合酶四聚體，并基于四聚體結(jié)構(gòu)研究了整合酶與病毒ＤＮＡ可能的結(jié)合模式以及金屬離子對結(jié)合的影響。其中Ｋａｒｋｉ等［２８］提供了３個模建路徑，得到３個模建結(jié)構(gòu)。模型１路徑具體為：①保留１ＥＸ４（ＣＴＤ＋ＣＣＤ）二體結(jié)構(gòu)，去除水，用Ｓｙｂｙｌ補全缺失殘基，而功能Ｌｏｏｐ區(qū)（殘基１３８～１４９）用ＰＤＢ庫中１ＢＬ３結(jié)構(gòu)［２９］補全，ＣＴＤ的部分走向用ＰＤＢ庫中１ＩＨＶ結(jié)構(gòu)［３０］校準；②用ＰＤＢ庫中１ＷＪＡ結(jié)構(gòu)［２３］補全ＮＴＤ部分，這樣得到了全長ＩＮ二聚體；③與１Ｋ６Ｙ四聚體［１８］疊落，獲得全長四聚體；④放置兩個金屬Ｍｇ２＋在ＤＤＥ口袋中，第一個手工放置，第二個參照１ＱＳ４結(jié)構(gòu)［１６］。圖２（Ｂ）給出了模型１結(jié)構(gòu)。模型２的路徑與模型１的區(qū)別有兩點：①ＮＴＤ結(jié)構(gòu)采用１Ｋ６Ｙ結(jié)構(gòu)［１８］而不是１ＷＪＡ［２３］；②兩個Ｍｇ２＋的位置參照１ＶＳＨ結(jié)構(gòu)［１５］，而非手動以及參照１ＱＳ４［１６］。圖２（Ｃ）給出了模型２結(jié)構(gòu)。模型３的路徑與模型２相近，只是模型３中ＣＴＤ的部分走向未用ＰＤＢ庫中１ＩＨＶ結(jié)構(gòu)［３０］校準，圖２（Ｄ）給出了模型３結(jié)構(gòu)。Ｋａｒｋｉ等［２８］的研究成果首次給出了ＩＮ與病毒ＤＮＡ及宿主ＤＮＡ的識別結(jié)果，證明Ｇｌｕ１５２、Ｇｌｎ１４８和Ｌｙｓ１５６是結(jié)合病毒ＤＮＡ的反應(yīng)部位（ＣＡ－ＯＨ３）的關(guān)鍵殘基；以及功能Ｌｏｏｐ區(qū)（殘基１４０～１４９）主要是通過隔開病毒ＤＮＡ和宿主ＤＮＡ，從而起到穩(wěn)定ＩＮ和復(fù)合物的作用。Ｗｉｅｌｅｎｓ等［２７］還用ＧＲＩＤ程序?qū)⒁幌盗校桑我种苿拥剑桑嗡木垠w－病毒ＤＮＡ－宿主ＤＮＡ上，這些對接結(jié)果都與已有的試驗信息相吻合，并且對ＩＮ與ＤＮＡ結(jié)合模式提供了一些有用的信息。Ｗａｎｇ等［３１］搭建了一個與Ｋａｒｋｉ等［２８］提供的類似全長的ＩＮ四聚體結(jié)構(gòu)，首次定量考慮了金屬離子對于ＩＮ與病毒ＤＮＡ相互作用的影響；Ｋｅ等［３２］利用ＰＤＢ庫中已有的片段結(jié)構(gòu)，也搭建了一個ＩＮ四聚體，并把不同長度的病毒ＤＮＡ對接到該平臺中，結(jié)果表明，ＩＮ四聚體中有３個ＤＮＡ結(jié)合區(qū)域，有兩個應(yīng)該是病毒ＤＮＡ結(jié)合區(qū)，另一個是宿主ＤＮＡ結(jié)合區(qū)。

３同源蛋白酶－ＤＮＡ復(fù)合物結(jié)構(gòu)

在ＨＩＶ－１的生命周期中，ＨＩＶ－１ ＩＮ主要是將病毒ＤＮＡ整合到宿主細胞染色體中，整個催化反應(yīng)前提是ＩＮ與病毒ＤＮＡ的特異性識別與結(jié)合。在生理狀態(tài)下，病毒ＤＮＡ先與ＩＮ結(jié)合，隨后發(fā)生３ＥＰ反應(yīng)。在藥物設(shè)計中，如果知道ＨＩＶ－１ ＩＮ與病毒ＤＮＡ的結(jié)合位點，就可以有針對性地尋找阻斷ＨＩＶ－１ ＩＮ與病毒ＤＮＡ結(jié)合的抑制劑，阻斷ＨＩＶ－１的復(fù)制過程。盡管上面提到了Ｌｕｃａ等［２１］、Ｗｉｅｌｅｎｓ等［２７］和Ｋａｒｋｉ等［２８］均搭建出ＩＮ－ＤＮＡ模型，這些為ＨＩＶ ＩＮ的催化機理以及ＩＮ抑制劑的合理設(shè)計研究提供了許多有益的信息，但是它們依然無法完全滿足當前ＩＮ抑制劑設(shè)計工作的需要。因為在以往的ＩＮ－ＤＮＡ模型構(gòu)建過程中，涉及到ＩＮ二聚體、四聚體以及病毒ＤＮＡ的模建，模建誤差對后續(xù)計算結(jié)果準確性會造成一定的影響?？傊瑹o論單獨的全長ＩＮ還是與病毒ＤＮＡ的復(fù)合物結(jié)構(gòu)都缺失，盡管ＨＩＶ整合酶抑制劑Ｒａｌｔｅｇｒａｖｉｒ已經(jīng)用于臨床，但是其作用機制仍未知。

Ｓｔｅｉｎｉｇｅｒ等［３３］解析出Ｔｎ５轉(zhuǎn)座酶與ＤＮＡ末端形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)（ｐｄｂ代碼：１ＭＵＳ），首次提供了轉(zhuǎn)座／整合路徑分析的三維結(jié)構(gòu)。細菌Ｔｎ５轉(zhuǎn)座酶和ＨＩＶ－１ ＩＮ同屬于聚核苷酸轉(zhuǎn)移酶家族，催化機制類似。Ｔｎ５轉(zhuǎn)座酶常用于ＤＮＡ轉(zhuǎn)移研究的模型系統(tǒng)，和ＨＩＶ－１ ＩＮ一樣內(nèi)含３個保守的氨基酸殘基（Ａｓｐ９７、Ａｓｐ１８８、Ｇｌｕ３２６，即ＤＤＥ基序），與金屬Ｍｎ２＋穩(wěn)定結(jié)合，共同對酶的ＤＮＡ轉(zhuǎn)移活性起關(guān)鍵性的作用。Ｔｎ５－ＤＮＡ復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的Ｍｎ２＋被Ａｓｐ９７、Ｇｌｕ３２６和ＤＮＡ的３′－ＯＨ所定位，共同構(gòu)成的活性口袋在三維結(jié)構(gòu)上與ＨＩＶ－１ ＩＮ非常相似。與ＨＩＶ－１

ＩＮ一樣，Ｔｎ５轉(zhuǎn)座酶的活性口袋區(qū)中含多個Ｌｙｓ殘基，參與結(jié)合ＤＮＡ末端序列。另外，Ｔｎ５活性口袋區(qū)中的兩個金屬離子得到解析，支持雙金屬參與ＩＮ催化的觀點。在ＨＩＶ－１ ＩＮ－ＤＮＡ復(fù)合物結(jié)構(gòu)缺乏的情況下，該結(jié)構(gòu)是一個很好開展ＤＮＡ轉(zhuǎn)移機制研究的平臺［３４］。圖３（Ａ）給出了Ｔｎ５轉(zhuǎn)座酶的三維結(jié)構(gòu)，兩個Ｍｎ２＋和ＤＤＥ基序殘基分別用黑色ＣＰＫ和粉紅色Ｓｔｉｃｋ表示，蛋白質(zhì)和ＤＮＡ部分則分別用綠色Ｓｏｌｉｄ ｒｉｂｂｏｎ和黃色Ｓｔｉｃｋ表示。

最近，Ｈａｒｅ等［３５］用Ｘ－ｒａｙ方法解析出全長的原核泡沫病毒（Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ，ＰＦＶ）ＩＮ與病毒ＤＮＡ的復(fù)合體三維結(jié)構(gòu)（ｐｄｂ代碼：３ＯＹＡ）。晶體結(jié)構(gòu)由ＰＦＶ ＩＮ四聚體和兩條病毒ＤＮＡ組成，其中ＰＦＶ ＩＮ與ＨＩＶ－１ ＩＮ高度同源，均屬于聚核苷酸轉(zhuǎn)移酶家族。ＰＦＶ ＩＮ保留了ＨＩＶ－１ ＩＮ中高度保守的ＤＤＥ活性口袋區(qū)以及雙金屬催化中心。Ｔａｎｇ等［３６］的對接試驗表明，一系列ＨＩＶ－１ ＩＮ抑制劑在ＰＦＶ ＩＮ中的結(jié)合位置和在ＨＩＶ－１中的結(jié)合位置相同，均是在ＤＤＥ活性口袋區(qū)。鑒于晶體庫中ＰＦＶ ＩＮ含ＨＩＶ－１ ＩＮ沒有但又十分重要的一些結(jié)構(gòu)信息，比如酶多聚化和病毒ＤＮＡ的結(jié)合位置等，所以ＰＦＶ ＩＮ可以作為基于結(jié)構(gòu)的抗ＡＩＤＳ藥物研發(fā)的一個有效靶點。

４結(jié)語

從原子水平上研究ＨＩＶ－１ ＩＮ催化位點的結(jié)構(gòu)信息和作用機理，進而為基于結(jié)構(gòu)的ＩＮ抑制劑設(shè)計具有重要的意義。本文把握國內(nèi)外當前對ＩＮ結(jié)構(gòu)研究的前沿，總結(jié)了該領(lǐng)域一系列代表性成果，希望借此引起讀者的關(guān)注。

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