李 強(qiáng)，唐 微，鄭 偉，孫 劍

(鄖陽醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000)

杜仲粗多糖脫蛋白方法的對比研究

李 強(qiáng)，唐 微，鄭 偉，孫 劍

(鄖陽醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000)

采用Sevag法、三氯乙酸法和鹽酸法對杜仲粗多糖脫蛋白，并測定蛋白質(zhì)脫除率、多糖損失率和總抗氧化能力損失率。結(jié)果表明，3%三氯乙酸脫蛋白效果較好且不影響多糖總抗氧化能力，此條件下，蛋白質(zhì)脫除率為53.32%，多糖損失率為3.67%。

杜仲，多糖，脫蛋白，抗氧化能力

杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)廣泛分布于陜西、甘肅、湖北等地，其樹皮具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎等功效，是傳統(tǒng)名貴中藥材。多糖是杜仲皮的重要活性成分，具有增強(qiáng)免疫、肝損傷保護(hù)等作用［1-3］。脫除雜蛋白是多糖純化的重要環(huán)節(jié)，相關(guān)研究常以蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率為指標(biāo)優(yōu)選脫蛋白方法，而較少考慮多糖活性的變化［4-7］。FRAP法是一種評價(jià)天然產(chǎn)物總抗氧化能力的簡便方法，原理是抗氧化物質(zhì)能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，通過比色法可測出其抗氧化能力的高低［8］。目前，以FRAP法研究脫蛋白方法對多糖抗氧化能力的影響尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以蛋白質(zhì)脫除率、多糖損失率和總抗氧化能力損失率為指標(biāo)，研究Sevag法、三氯乙酸法和鹽酸法脫蛋白對杜仲多糖的影響，為純化高抗氧化活性杜仲多糖奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲皮 購于十堰市中藥材公司，產(chǎn)地湖北;考馬斯亮藍(lán)G-250 美國Amresco公司;牛血清蛋白美國Sigma公司;總抗氧化能力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑 國產(chǎn)分析純。

HH·SY11-Ni型電熱恒溫水浴鍋 北京市長風(fēng)儀器儀表公司;RE-52D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海青浦滬西儀器廠;722S型可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;PHS-25型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 杜仲粗多糖的制備 藥材60℃烘干4h，粉碎，過40目篩，加入15倍85%乙醇，82℃回流脫脂2h，真空抽濾并用85%乙醇洗6次，烘干備用。藥粉加入水(料液比=1∶10)，于100℃水浴浸提2次，每次4h，提取液濃縮至1/18體積，加入3倍體積100%乙醇，4℃靜置4h，4000r/min離心10min，沉淀依次用乙醇、丙酮、乙醚洗滌，干燥得杜仲粗多糖。稱取3g粗多糖溶解并定容至500mL，得杜仲粗多糖溶液。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測定 以考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定蛋白質(zhì)含量［9］。以牛血清蛋白(100mg/L)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，595nm吸光度為橫坐標(biāo)，牛血清蛋白濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程:y= 141.97x-1.1787，R2=0.9992。

1.2.3 多糖含量測定 以蒽酮-硫酸法測定多糖含量［10］。以葡萄糖(100mg/L)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，620nm吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程:y=142.93x+0.1662，R2=0.9997。

1.2.4 多糖總抗氧化能力測定 按總抗氧化能力測定試劑盒說明書操作。在37℃時(shí)，每分鐘每毫升樣品液使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí)，為一個(gè)抗氧化能力單位(U)。

1.2.5 蛋白質(zhì)脫除率、多糖損失率和多糖總抗氧化能力損失率計(jì)算 見式(2)～式(4)。

式中:P1、R1、O1分別為原多糖液蛋白質(zhì)含量、多糖含量和總抗氧化能力;P2、R2、O2分別為脫蛋白后多糖液蛋白質(zhì)含量、多糖含量和總抗氧化能力。

1.2.6 Sevag法脫蛋白 取粗多糖溶液75mL于250mL三角瓶中，加水稀釋至150mL，加入0.2倍體積氯仿和0.04倍體積正丁醇，用磁力攪拌器攪拌30min，4000r/min離心10min，取少量上層清液進(jìn)行測定，剩余上層清液再加入0.2倍體積氯仿和0.04倍體積正丁醇，重復(fù)操作數(shù)次。

1.2.7 三氯乙酸法脫蛋白 取粗多糖溶液10份各20mL于50mL燒杯中，以1∶1體積加入三氯乙酸溶液，使其終濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，攪勻，4℃靜置12h，4000r/min離心10min，上清液定容至50mL進(jìn)行測定。

1.2.8 鹽酸法脫蛋白 取粗多糖溶液6份各20mL于50mL燒杯中，分別加入20mL水并用0.2mol/L鹽酸調(diào)pH至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，混勻，4℃靜置12h，4000r/min離心10min，上清液定容至50mL進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sevag法脫蛋白結(jié)果

由圖1可知，隨著Sevag法處理次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)脫除率、多糖損失率和多糖總抗氧化能力損失率均逐漸升高。Sevag法處理1次，蛋白質(zhì)脫除率為12.05%，多糖總抗氧化能力無損失，多糖損失率為46.14%，說明許多與蛋白質(zhì)結(jié)合的多糖被除去，這部分多糖無抗氧化作用，再增加處理次數(shù)，蛋白質(zhì)脫除率升高幅度遠(yuǎn)高于多糖損失率和總抗氧化能力損失率，說明較多游離蛋白被脫除。Sevag法處理6次后蛋白質(zhì)脫除率達(dá)最高為 32.82%，多糖損失率為47.97%，總抗氧化能力損失率為11.11%。

圖1 Sevag法脫蛋白的結(jié)果

2.2 三氯乙酸法脫蛋白結(jié)果

由圖2可知，隨著三氯乙酸濃度的增加，多糖損失率和總抗氧化能力損失率大致呈上升趨勢;蛋白質(zhì)脫除率未隨三氯乙酸濃度增加而逐漸升高。三氯乙酸為有機(jī)酸，可使蛋白質(zhì)變性并結(jié)合生成不溶性的鹽類，同時(shí)，羧基的解離也改變?nèi)芤旱膒H，影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，所以蛋白質(zhì)脫除率曲線出現(xiàn)多個(gè)拐點(diǎn)。三氯乙酸濃度為3%時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率為53.32%，多糖損失率為3.67%，總抗氧化能力無損失;三氯乙酸濃度升高至8%時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)最高為58.48%，此時(shí)多糖損失率為5.07%，總抗氧化能力損失率為16.67%，說明高濃度三氯乙酸對多糖結(jié)構(gòu)破壞較強(qiáng)，所以三氯乙酸濃度為3%較宜。

圖2 三氯乙酸法脫蛋白的結(jié)果

2.3 鹽酸法脫蛋白結(jié)果

由圖3可知，隨著多糖溶液pH降低，蛋白質(zhì)脫除率逐漸升高，多糖損失率逐漸增加后又降低，總抗氧化能力損失率大致呈升高趨勢。pH為2.0時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)最高為55.67%，多糖損失率為9.18%，總抗氧化能力損失率為13.89%。pH為2.5時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率為54.01%，多糖損失率為20.42%，總抗氧化能力損失率為8.33%。pH為2.5時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率略低于pH 2.0時(shí)，多糖損失率也較pH 2.0時(shí)高，但總抗氧化能力損失率較低，說明抗氧化多糖保得留更多，所以pH為2.5較宜。

圖3 鹽酸法脫蛋白的結(jié)果

2.4 三種方法綜合比較

將三種脫蛋白方法結(jié)果進(jìn)行綜合比較，由圖4可知，三氯乙酸法蛋白質(zhì)脫除率略低于鹽酸法，遠(yuǎn)高于Sevag法，但多糖損失率和總抗氧化能力損失率均比后兩種方法低，說明此條件下多糖活性結(jié)構(gòu)不被破壞同時(shí)大部分蛋白質(zhì)也被脫除，所以更適于杜仲粗多糖脫蛋白。

3 結(jié)論

脫除蛋白質(zhì)是多糖純化的必要環(huán)節(jié)，合理的脫蛋白方法應(yīng)較少影響多糖的活性。本實(shí)驗(yàn)對三種脫蛋白方法進(jìn)行對比研究，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)脫除率最高的是鹽酸法，而多糖損失率和總抗氧化能力損失率最小的是三氯乙酸法。綜合考慮蛋白質(zhì)脫除率、多糖損失率和總抗氧化能力損失率，采用3%濃度三氯乙酸脫除杜仲粗多糖蛋白質(zhì)較宜，蛋白質(zhì)脫除率為53.32%，多糖損失率為3.67%，總抗氧能力此條件下無損失。

圖4 三種脫蛋白方法綜合比較

［1］ Gonda R，Tomoda M，Shimizu N，et al.An acidicpolysaccharide having activity on the reticuloendothelial system from the bark of Eucommia ulmoides［J］.Chem Pharm Bull，1990，38(7):1966-1969.

［2］Tomoda M，Gonda R，Shimizu N，et al.A reticuloendothelial system-activating glycan from the barks of Eucommia ulmoides［J］.Phytochemistry，1990，29(10):3091-3094.

［3］辛?xí)悦鳎瘥?，王浩，?杜仲多糖對環(huán)磷酰胺致小鼠毒性的影響［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20(7):1664-1665

［4］秦衛(wèi)東，馬利華，陳學(xué)紅，等.生姜多糖的提取及脫蛋白研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(4):218-220.

［5］劉鳳，陶慧卿，何培民.條斑紫菜多糖脫蛋白方法與條件優(yōu)化［J］.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，16(2):140-143.

［6］張慧玲，任秀蓮，魏琦峰，等.海帶多糖的脫蛋白研究［J］.中成藥，2008，30(9):1370-1373.

［7］毛英麗，王忠民，李瑾瑜，等.葡萄多糖脫蛋白方法的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29(4):42-44.

［8］李秋紅，李廷利，黃莉莉，等.中藥抗氧化的作用機(jī)理及評價(jià)方法研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19(5):1257-1258.

［9］李合生，孫群，趙世杰，等.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2000:182-185.

［10］王憲澤.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理和方法［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002:52-54.

Study on the comparison of different methods for deproteinization from crude polysaccharide of Eucommia ulmoides Oliver

LI Qiang，TANG Wei，ZHENG Wei，SUN Jian
(Yunyang Medical College，Shiyan 442000，China)

Sevag method，Trichloroacetic acid method and HCl method were used to remove protein from crude polysaccharide of Eucommia ulmoides Oliver and the percentage of deproteinization，the loss of polysaccharide and the loss of total antioxidant ability(TAA)were determined.The results showed that with concentration of trichloroacetic acid 3%，deproteinization was effective and TAA didn’t change.In this condition，the percentage of deproteinization was 53.32%，the loss of polysaccharide was 3.67%.

Eucommia ulmoides Oliver;polysaccharide;deproteinization;antioxidant ability

TS201.2+3

B

1002-0306(2011)03-0316-03

2010-03-22

李強(qiáng)(1979-)，男，碩士，講師，從事生物活性成分研究。

鄖陽醫(yī)學(xué)院科研基金資助項(xiàng)目(2006QDJ06)。