肖凱夫，郭 晟，龐一林，林元山，*，鄒冬生，*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南長沙410128; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128)

產(chǎn)堿性脂肪酶熱帶假絲酵母LYSC-3的篩選、鑒定及發(fā)酵條件的優(yōu)化

肖凱夫1，2，郭 晟1，2，龐一林1，林元山1，2，*，鄒冬生1，2，*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南長沙410128; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128)

以橄欖油為唯一碳源，以溴鉀酚紫為顯色劑，采用瓊脂平板法從富含油脂的土壤中篩選到一株產(chǎn)堿性脂肪酶野生型菌株LYSC-3。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)的鑒定，確定菌株LYSC-3為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)。經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化，菌株LYSC-3的最佳產(chǎn)堿性脂肪酶的發(fā)酵條件為:橄欖油10g·L-1、蛋白胨5g·L-1、蔗糖20g·L-1、(NH4)2SO40.5g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2g·L-1，K2HPO40.2g·L-1，pH8.0，35℃，150r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)3d，獲得堿性脂肪酶最高酶活力達(dá)38.6U·mL-1。

堿性脂肪酶，發(fā)酵條件，假絲酵母，菌株篩選

1 材料與方法

1.1 實驗材料

篩選土樣 采自瀏陽河地區(qū)富含油脂的土壤;橄欖油 希臘原產(chǎn);溴鉀酚紫 購于天津市博迪化工有限公司;油脂同化平板培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、保藏培養(yǎng)基 均參考文獻(xiàn)［4］;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)堿性脂肪酶菌株的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.1.1 初篩 在配制好的油脂同化平板培養(yǎng)基中加入0.01%溴甲酚紫，溴甲酚紫為指示劑，溴甲酚紫在pH5.2～6.8，顏色由紫變黃［5］。采用十倍稀釋涂布接種法，35℃培養(yǎng)2～4d，根據(jù)平板上黃色變色圈直徑與產(chǎn)脂肪酶菌株菌落直徑的比值，進(jìn)行菌株活力初篩，按水解圈直徑與菌落直徑之比挑取菌株，接種斜面;選擇比值大的菌株進(jìn)一步進(jìn)行搖瓶發(fā)酵并測定脂肪酶活力。

1.2.1.2 復(fù)篩 將初篩產(chǎn)堿性脂肪酶活力相對較高的菌種接種于100mL/250mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，35℃，200r·min-1搖床振蕩培養(yǎng) 72h，將發(fā)酵液8000r·min-1離心20min，沉淀用于計算生物量，上清液用于測定酶活力，選擇酶活力大的菌株進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。

1.2.1.3 發(fā)酵條件優(yōu)化 設(shè)計單因素實驗，對菌株LYSC-3的培養(yǎng)基碳源(橄欖油)、培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度等單因素進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。

1.2.2 酶活測定方法 堿滴定測酶活［6］，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 分離菌種的鑒定 參照《常見真菌鑒定手冊》［7］進(jìn)行菌種LYSC-3的生理生化鑒定。

1.2.4 26s RNA的PCR擴(kuò)增、序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建［8］以NL1(5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')和NL4(5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3'為引物PCR擴(kuò)增，經(jīng)北京諾賽基因組研究中心有限公司測序26s RNA序列，LYSC-3菌株的測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastn搜索，獲得與其同源性相近的序列，然后用Clustal X1.8軟件進(jìn)行多序列比對，最后利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Kimura雙參數(shù)模型計算各序列分化距離，缺少和不確定的位點在計算中被省略，Boot-strap置信值估算次數(shù)1000次。

1.2.5 生物量的測定 采用濕重法測定LYSC-3菌株的生物量，將發(fā)酵液以8000r·min-1于高速離心機中離心20min，并用濾紙吸取菌體表面水，稱量菌體濕重量，計g·L-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)堿性脂肪酶菌株的篩選

從富含油脂的土樣中采集樣品，按水解變色圈直徑與菌落直徑的比值大小挑選菌株，得到比值大于4.0的脂肪酶菌株21株，比值大于6.5的脂肪酶菌株7株，經(jīng)反復(fù)初篩，搖瓶復(fù)篩后，獲得1株酶活力相對較高的菌株，標(biāo)注為LYSC-3菌株，該菌株水解變色圈直徑與菌落直徑的比值為9.6，該菌株的溴鉀酚紫顯色平板見圖1。

由于微生物產(chǎn)脂肪酶可降解培養(yǎng)基中底物橄欖油產(chǎn)生脂肪酸和甘油，脂肪酸使中性的油脂同化平板培養(yǎng)基pH降低，培養(yǎng)基部分局域顏色由紫變黃，因此，平板上黃色變色圈直徑與產(chǎn)脂肪酶菌株菌落直徑的比值初步反映了脂肪酶活力大小。由圖1可以看出，所獲菌株產(chǎn)脂肪酶活力高且酶活穩(wěn)定。

圖1 菌株Candida tropicalis LYSC-3在篩選培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的生理生化特性 菌株 LYSC-3在麥芽汁瓊脂上菌落為奶油色，稍有光澤，軟而平滑。培養(yǎng)4d后，可看到假菌絲。在顯微鏡下呈現(xiàn)球狀或卵狀形，見圖2。菌株LYSC-3兼性厭氧發(fā)酵葡糖;接觸酶實驗為陽性;葡萄糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、木糖和阿拉伯糖為陽性，鼠李糖為陰性，從形態(tài)學(xué)初步確定為酵母屬。

圖2 Candida tropicalis LYSC-3光學(xué)顯微照片(放大1000倍)注:A-未染色;B-結(jié)晶紫染色。

2.2.2 遺傳學(xué)特征 為了進(jìn)一步確定菌株 LYSC-3的分類學(xué)地位，通過PCR擴(kuò)增26s RNA得到603bp的DNA片段，將片段回收純化后測序，測序結(jié)果提交GenBank，獲得登錄號GU388393，使用生物軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，見圖3。LYSC-3菌株與Candida屬內(nèi)各菌株的同源性在95.90%～99.90%之間，系統(tǒng)發(fā)育分析歸于同一分枝，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，確定其為Candida tropicalis屬，命名為 Candida tropicalis LYSC-3菌株。

圖3 Candida tropicalis LYS-3菌株及相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 LYSC-3菌株的產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

為確定LYSC-3菌株的產(chǎn)酶條件，設(shè)計單因素實驗梯度，對發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基起始pH、橄欖油含量進(jìn)行發(fā)酵條件初步優(yōu)化，將測定的酶活力用excel作圖，結(jié)果見圖4～圖6。

圖4 發(fā)酵溫度對菌株Candida tropicalis LYSC-3產(chǎn)脂肪酶的影響

發(fā)酵溫度對菌株Candida tropicalis LYSC-3產(chǎn)脂肪酶的影響見圖4，從圖4可知，Candida tropicalis LYSC-3在30～37℃之間生長良好，菌體濕重在16～17g·L-1之間。35℃時，該菌的脂肪酶活力達(dá)最大，達(dá)35.2U·mL-1，其次為37℃和32℃，分別為33.7U·mL-1和30.8U·mL-1，經(jīng)t檢驗，這三個溫度的脂肪酶活力與低溫區(qū)和高溫區(qū)比較，均具顯著性差異(p＜0.05)。

從圖5可知，在35℃條件下，Candida tropicalis LYSC-3在發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH5～7之間生長良好，菌體濕重在15～16g·L-1之間。發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH為8時，該菌的脂肪酶活力達(dá)最大，達(dá)36.4U·mL-1;然后隨著pH的增加，該菌的脂肪酶酶活力和生物量均顯著降低，經(jīng)t檢驗，該菌株的脂肪酶活力與其低pH區(qū)和高pH區(qū)比較，均具顯著性差異(p＜0.05)，可見，培養(yǎng)基起始pH影響脂肪酶活力和生物量的大小。

圖5 培養(yǎng)基起始pH對菌株Candida tropicalis LYSC-3產(chǎn)脂肪酶的影響

在35℃，pH8的條件下，在發(fā)酵培養(yǎng)基(每1000mL)中橄欖油含量對Candida tropicalis LYSC-3產(chǎn)脂肪酶活力影響見圖6，從圖6可知，欖油含量從0增加至10mL，脂肪酶活力增加較快。橄欖油含量為10mL時，接近最大，達(dá)38.6U·mL-1，與橄欖油含量3～6mL比較，具顯著性差異(p＜0.05)，然后隨著橄欖油含量的增加，脂肪酶活力基本趨于穩(wěn)定。但橄欖油含量對Candida tropicalis LYSC-3生物量的貢獻(xiàn)不明顯，而對脂肪酶產(chǎn)率影響很大，說明橄欖油含量對Candida tropicalis LYSC-3產(chǎn)脂肪酶具有明顯的誘導(dǎo)作用，也是影響脂肪酶分泌的關(guān)鍵因素之一。

3 討論

圖6 橄欖油對菌株Candida tropicalis LYSC-3產(chǎn)脂肪酶的影響

目前，通過誘變等手段，獲得脂肪酶產(chǎn)生菌的報道甚多，但酶活力大多在70U·mL-1以下，如曾璐等［9］以三羧酸甘油脂為底物，篩選一株產(chǎn)脂肪酶桿菌，酶活力為68.58U·mL-1;張振乾等［10］從含油土樣中篩選到一株產(chǎn)堿性脂肪酶的產(chǎn)氣腸桿菌，酶活力為66.31U·mL-1;周軍［11］以橄欖油為底物，從富含油脂的土壤中分離篩選到產(chǎn)脂肪酶R-1野生型菌株，酶活力為27.70U·mL-1。本實驗從富含油脂的土壤中篩選到一株產(chǎn)堿性脂肪酶菌株Candida tropicalis LYSC-3，未經(jīng)任何誘變，在初步優(yōu)化的發(fā)酵條件下，堿性脂肪酶活力就達(dá)38.6U·mL-1，可見該菌株具有較大的開發(fā)潛力。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為熱帶假絲酵母Candida tropicalis LYSC-3，關(guān)于熱帶假絲酵母產(chǎn)堿性脂肪酶的報道甚少。該菌株可以進(jìn)一步通過誘變篩選提高酶活，甚至采用基因工程技術(shù)對該酶基因進(jìn)行克隆，有望進(jìn)一步發(fā)掘其潛能。

總之，野生型Candida tropicalis LYSC-3的最佳產(chǎn)堿性脂肪酶發(fā)酵條件為:橄欖油10g·L-1、蛋白胨5g·L-1、蔗糖 20g·L-1、(NH4)2SO40.5g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2g·L-1、K2HPO40.2g·L-1，pH8.0，35℃，150r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)3d，獲得堿性脂肪酶最高酶活力達(dá)38.6U·mL-1。

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Screening，identification of Candida tropicalis LYSC-3 excreting lipase and optimization of fermenting conditions

XIAO Kai-fu1，2，GUO Sheng1，2，PANG Yi-lin1，LIN Yuan-shan1，2，*，ZOU Dong-sheng1，2，*
(1.Orient Science＆Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China; 2.College of Bioscience＆Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

A strain of LYSC-3 was screened by bromocresol purple media agar plate from oil rich soil.LYSC-3 was identified as Candida tropicalis by methods of morphology，physiology and molecular biology.Fermentation conditions were also optimized through single factor.Results indicated that lipase activity reached 38.6U·mL-1when Candida tropicalis LYSC-3 was cultured on the media of olive oil 10g·L-1，peptone 5g·L-1，sugar 20g·L-1，(NH4)2SO40.5g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2g·L-1，K2HPO40.2g·L-1，pH8.0，rotated at 150r·min-1at 35℃for 3d.

alkaline lipase;fermentation condition;Candida tropicalis;screening

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0218-03

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一種重要工業(yè)酶類，能催化天然底物油脂生成甘油和游離脂肪酸，廣泛應(yīng)用于食品、制革、飼料、洗滌、油酯化工等傳統(tǒng)工業(yè)領(lǐng)域［1］。脂肪酶的來源主要有:植物種子、微生物和動物組織［2］。微生物脂肪酶種類最多，廣泛存在于細(xì)菌、酵母和霉菌中，最易獲得并用于大規(guī)模生產(chǎn)，且具有比動植物脂肪酶更廣的pH、溫度適應(yīng)性，因此是工業(yè)用脂肪酶的重要來源［3］。近20年來，微生物脂肪酶發(fā)酵研究主要集中在高產(chǎn)菌株的篩選。本實驗旨在通過溴鉀酚紫平板顯色法和堿滴定測脂肪酶活法相組合的篩選方案，獲得脂肪酶高產(chǎn)野生菌株，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2010-03-17 *通訊聯(lián)系人

肖凱夫(1986-)，男，碩士研究生，研究方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目(DFXYKCSJ003)。