馬 寧，楊培君，李會(huì)寧，裴會(huì)鵬，黃 俊

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723001)

石參多糖的體外抗氧化活性研究

馬 寧，楊培君*，李會(huì)寧，裴會(huì)鵬，黃 俊

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723001)

采用水提醇沉法提取石參粗多糖，通過比色法測(cè)定石參多糖對(duì)羥自由基(·OH)、超氧陰離子(·)、過氧化氫(H2O2)和2，2-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)的清除率，并與VC進(jìn)行比較，從而對(duì)石參多糖的抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，石參多糖具有一定的體外抗氧化能力，與陽性對(duì)照VC相比，石參多糖對(duì)H2O2有較強(qiáng)的清除能力，對(duì)DPPH·、·OH和·具有不同的清除活性，清除率與石參多糖濃度呈正相關(guān)性。

石參，多糖，抗氧化作用

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

石參 購于陜西省漢中市略陽縣產(chǎn)地加工產(chǎn)品，烘干，粉碎，過50目篩，備用;鄰苯三酚(焦性沒食子酸)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、抗壞血酸(VC)、鄰菲啰啉、硫酸亞鐵、30%過氧化氫(H2O2)、2，2-二苯基苦基苯肼(DPPH)、無水乙醇、無水乙醚、丙酮、正丁醇、三氯甲烷和鹽酸均為分析純。

AL204電子天平 梅特勒;UV-2550紫外分光光度計(jì) 日本島津;數(shù)顯恒溫水浴鍋 北京科偉; RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石參粗多糖的制備 取一定量石參粉末，置于索氏提取裝置中，加入乙醚，45℃回流浸提，以脫去表面脂肪;揮干乙醚，然后加入80%乙醇，熱回流去雜3次，每次2h，抽濾。濾渣在90℃，料液比1∶50條件下浸提2次，每次3h。濃縮濾液，采用Sevag法除蛋白，以1∶4加入無水乙醇，有絮狀凝膠物和粒狀沉淀析出，靜置過夜。抽濾，濾渣依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌，60℃干燥得淡黃色粉末，即石參粗多糖。

1.2.2 各體系特征吸收波長的確定

1.2.2.1 多糖清除羥自由基(·OH)特征波長的確定

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法［15］，取75mmol/L鄰二氮菲1.0mL，加入 150mmol/L pH 7.4磷酸緩沖液(PBS)1.5mL，充分混勻后，加入7.5mmol/L FeSO4溶液1.0mL，每加一管立即混勻，加0.01%H2O21.0mL，最后以蒸餾水補(bǔ)充至總體積為10.0mL。反應(yīng)液37℃保溫1h后，掃描其300～600nm范圍內(nèi)的紫外吸收曲線，其特征吸收波長為536nm。

1.2.2.2 多糖清除DPPH·特征波長的確定 按文獻(xiàn)［16］方法略加改動(dòng)，準(zhǔn)確稱取10.0mg DPPH，用50%乙醇定容于250mL容量瓶中，得到濃度為1×10-4mol/L的 DPPH溶液。取4.0mL DPPH溶液，加入4.0mL 50%乙醇，搖勻，25℃環(huán)境中放置40min，掃描其450～550nm范圍內(nèi)的紫外吸收曲線，其特征吸收波長為517nm。

1.2.2.3 多糖清除超氧陰離子自由基(O2-·)特征波長的確定 取4.5mL50mmol/LTris-HCl緩沖液(pH =8.2)，4.2mL蒸餾水，混勻，置于25℃條件下保溫20min后立即加入25℃預(yù)熱過的0.3mL 3mmol/L鄰苯三酚溶液，且加入后快速搖勻，掃描其300～500nm范圍內(nèi)的紫外吸收曲線，其特征吸收波長為325nm。

1.2.3 石參多糖抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1 多糖對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用 根據(jù)

1.2.2.1 方法所測(cè)出的吸光度值為A損傷，樣品管中依次加入1.0mL不同濃度多糖溶液后再加入H2O2，37℃保溫1h，在特征吸收波長處測(cè)A加樣。未損傷管為不加H2O2及多糖溶液。VC為陽性對(duì)照。按下式計(jì)算自由基清除率。

1.2.3.2 清除DPPH·能力的測(cè)定方法 依1.2.2.2方法，將4.0mL蒸餾水用不同濃度石參多糖樣品代替，以特征吸收波長處的吸光度Ai，以4.0mL 50%乙醇代替樣品得吸光度Ac，代替DPPH得吸光度記作空白校正Aj值。以VC作為對(duì)照。按下式計(jì)算自由基清除率。

1.2.3.3 多糖對(duì)過氧化氫(H2O2)清除率的測(cè)定 依文獻(xiàn)［21］方法，在試管中加入由50mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)配制的0.5mmol/L H2O2溶液2.8mL，再加入不同濃度的多糖溶液1.0mL后，用純凈水補(bǔ)齊至10.0mL，室溫放置10min后，于230nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)樣品，對(duì)照管為不加多糖溶液。以VC作為對(duì)比。按下式計(jì)算自由基清除率。

氧化速率=(最后1次記錄值-第1次記錄值)/4

清除率(%)=(自氧化管氧化速率-樣品管氧化速率)/自氧化管氧化速率×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 石參多糖對(duì)·OH的清除作用

石參粗多糖和VC對(duì)·OH的清除效果如圖1所示。不同濃度的石參粗多糖對(duì)H2O2/Fe2+體系通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH具有清除作用，且在所選濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增大，清除率上升，即清除率與多糖的濃度二者呈正相關(guān)。作為對(duì)照的VC在濃度為1.0mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到100%;而石參粗多糖濃度為4.5mg/mL時(shí)僅有20.6%的清除率，7.0mg/mL時(shí)清除率才達(dá)100%。表明VC清除·OH自由基活性優(yōu)良，且清除能力優(yōu)于石參粗多糖。

圖1 石參多糖和VC對(duì)·OH的清除能力

2.2 石參多糖對(duì)DPPH·的清除作用

由圖2可知，在一定的濃度范圍內(nèi)，石參多糖對(duì)DPPH·的清除率和多糖濃度呈一定的量效關(guān)系，隨著石參多糖濃度的增加，石參多糖對(duì)DPPH·的清除率也逐步增加。石參多糖對(duì)DPPH·的清除率最終能達(dá)到100%，但此時(shí)所需石參多糖的最小質(zhì)量濃度為3.5mg/mL，而VC對(duì)DPPH·的最大清除率僅為94%，所需的最小質(zhì)量濃度為0.12mg/mL。由此可見，在相同條件下，石參多糖對(duì)DPPH·的清除效果更加徹底，但清除能力遠(yuǎn)弱于VC。

圖2 石參多糖和VC對(duì)DPPH·的清除能力

2.3 石參多糖對(duì)過氧化氫(H2O2)的清除作用

石參多糖和VC對(duì)H2O2的清除率都與濃度呈一定的量效關(guān)系，隨著濃度的增加，二者對(duì)H2O2的清除率也逐步增加。在0.4～0.9mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC的清除能力略優(yōu)于石參多糖，當(dāng)濃度高于0.9mg/mL時(shí)，與VC相比，石參多糖對(duì)H2O2的清除能力較強(qiáng)，清除率達(dá)到100%時(shí)，石參多糖的最小濃度為1.4mg/mL，而VC的最小濃度為1.6mg/mL。表明石參多糖對(duì)H2O2的清除能力優(yōu)于VC(圖3)。

圖3 石參多糖和VC對(duì)H2O2的清除能力

由圖4可知，石參多糖對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O-2·具有一定的抑制作用，并隨濃度的增加其清除率逐漸上升，二者呈正相關(guān)。與VC相比，石參多糖濃度為10 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到100%，而VC在濃度為0.28mg/mL時(shí)已達(dá)最大清除率，說明VC清除的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于石參多糖。

圖4 石參多糖和VC對(duì)·的清除能力

3 討論

隨著人們對(duì)健康的關(guān)注，減少自由基對(duì)人體的危害，尋找低毒、高效的天然抗氧化劑已成為現(xiàn)今的研究熱點(diǎn)，國內(nèi)外學(xué)者一直在不斷尋找能有效清除自由基活性的抗氧化食品［18］。本實(shí)驗(yàn)通過4種體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯苛耸秤觅Y源石參多糖的體外抗氧化活性。研究表明，石參多糖在各種體系中均表現(xiàn)出一定的清除能力，但強(qiáng)弱程度并不完全一致。與VC相比，石參多糖對(duì)H2O2有較強(qiáng)的清除作用，濃度高于0.9mg/mL時(shí)，石參多糖對(duì)H2O2的清除能力甚至高于陽性對(duì)照VC;對(duì)·OH和DPPH·的清除作用較弱;而對(duì)O2-·的清除作用最弱，需要較高的多糖濃度才能抑制O2-·。這是由于每一個(gè)反應(yīng)體系的組成組分并不相同，發(fā)生的反應(yīng)及抗氧化作用的機(jī)理也不相同。

目前，植物多糖體外抗氧化活性研究報(bào)道較多，張蓮姬等［19］對(duì)桔梗多糖抗氧化活性研究表明，桔梗多糖清除·OH的效果優(yōu)于對(duì)O2-·的清除效果，這與石參多糖對(duì)二者的清除效果一致，但石參多糖對(duì)二者的清除作用弱于桔梗多糖。張澤慶等［20］采用相同的體系研究了防風(fēng)多糖對(duì)·OH，DPPH·和O2-·的清除作用，結(jié)果表明，在多糖濃度為8.0mg/mL時(shí)，防風(fēng)多糖對(duì)·OH和DPPH·的清除率均接近70%，而石參多糖在7mg/mL和3.5mg/mL，就已經(jīng)分別達(dá)到二者的最大清除率(100%)，所以石參多糖對(duì)·OH和DPPH·的清除力強(qiáng)于防風(fēng)多糖。目前，有關(guān)多糖清除H2O2方面的研究較少，茹巧美等［21］研究了忽地笑多糖對(duì)H2O2的清除作用，結(jié)果表明忽地笑多糖對(duì)H2O2的清除率達(dá)50%時(shí)所需的濃度小于0.1mg/mL;而石參多糖清除H2O2的能力明顯弱于忽地笑多糖。

本研究的某些模型中，石參多糖表現(xiàn)出的抗氧化活性并不及其陽性對(duì)照物VC，但石參是一種野生食用資源，其多糖類物質(zhì)可以作為一種純天然抗氧化劑，在為人體提供多種營養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，石參多糖也能抑制人體一部分有害自由基的產(chǎn)生。另外，目前已有研究表明，對(duì)已有的抗氧化多糖進(jìn)行硫酸化、硒化等結(jié)構(gòu)修飾后，所得的硫酸化多糖和硒化多糖比修飾前的抗氧化活性有較大改善［22-23］。因此，尋找和研究植物活性多糖資源倍受關(guān)注;對(duì)石參多糖進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造，有望得到一種安全高效、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的天然抗氧化劑，并在食品、醫(yī)藥工業(yè)、化妝品等行業(yè)應(yīng)用，將拓寬石參產(chǎn)品的應(yīng)用范圍，提高其資源價(jià)值。

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Study on antioxidant effect of polysaccharide from Shishen(Eremurus chinensis)in vitro

MA Ning，YANG Pei-jun*，LI Hui-ning，PEI Hui-peng，HUANG Jun
(School of Biological Sciences and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，China)

The polysaccharides from Shishen(Eremurus chinensis)were obtained through water extracting and ethanol precipitating method.Clearance rate of the polysaccharides to hydroxyl radical(·OH)，superoxide anion·)，hydrogen peroxide(H2O2)and 2，2-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH·)was determined by UV method，and compared with VC.Then the antioxidant effects of polysaccharides were studied.The results showed the polysaccharide had certain antioxidant capacity through comparing with positive control VC.The polysaccharide had stronger capacity of scavenging on the H2O2and had different scavenging activity on the DPPH·，·OH and·.It was indicted to a positive correlation with concentration of polysaccharides.

Shishen(Eremurus chinensis);polysaccharide;antioxidant effect

TS201.1

A

1002-0306(2011)11-0148-04

石參屬百合科獨(dú)尾草屬獨(dú)尾草(Eremurus chinensis Fedtsch)［1］肉質(zhì)根加工的一種稀有山野菜。獨(dú)尾草屬在我國有4種，1種產(chǎn)于西南，3種產(chǎn)于新疆［2］。陜西省略陽縣有獨(dú)尾草分布，屬陜西分布新記錄屬植物［3］。石參又名石蒜苔、崖參(陜西略陽)，食用部分是肉質(zhì)根，味甘甜，營養(yǎng)豐富，是陜西南部山區(qū)一種稀見的山野菜［3］?？寡趸钚允潜＝∈称返?7種保健功能之一，它能有效清除體內(nèi)有害自由基，防止自由基對(duì)生物大分子的氧化損傷，保證細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的正常［4］。研究自由基與病理現(xiàn)象的關(guān)系，尋找其清除劑已成為目前十分活躍的研究領(lǐng)域。多糖具有免疫調(diào)節(jié)［5-6］、抗腫瘤活性［7］及抗病毒［8-9］、抗氧化［10］和防衰老［11-12］等作用，而這些作用主要又與多糖的抗氧化作用相關(guān)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)許多中藥多糖都具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化，從而保護(hù)生物膜的作用［13］。目前，獨(dú)尾草屬植物多糖的研究報(bào)道較少，未見其清除活性自由基方面的研究報(bào)道。因此本文對(duì)石參粗多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，以期為發(fā)揮資源潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

2010-11-09 *通訊聯(lián)系人

馬寧(1984-)，男，在讀碩士，研究方向:植物生物技術(shù)。

陜西省教育廳研究項(xiàng)目(08JK251);陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育項(xiàng)目(SLGJD0803)。