劉曉芳,劉養(yǎng)清,韓雪,焦建華,陳元元
(山西中醫(yī)學(xué)院,山西 太原 030024)
質(zhì)量
不同產(chǎn)地大棗中多糖的含量測定
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劉曉芳,劉養(yǎng)清*,韓雪,焦建華,陳元元
(山西中醫(yī)學(xué)院,山西 太原 030024)
目的:建立大棗中多糖的提取和含量測定方法。方法:采用苯酚-硫酸顯色-分光光度法測定不同產(chǎn)地大棗中多糖的含量,對不同的提取方法和影響顯色反應(yīng)的主要因素進(jìn)行了考察。結(jié)果:測定了不同產(chǎn)地大棗中多糖的含量,其差異很大。結(jié)論:該方法測定多糖含量具有操作簡單、精密度高、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好的優(yōu)點,可用于大棗的質(zhì)量控制。
大棗;多糖;分光光度法;苯酚-硫酸顯色法;質(zhì)量控制
大棗為鼠李科植物棗ZizyphusjujubaMill.的干燥成熟果實[1],具有補中益氣,養(yǎng)血安神的功能[1]。大棗營養(yǎng)豐富,既可食用又可入藥,富含糖類、粗纖維、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[2-3]。研究表明,大棗多糖是大棗中具有重要生物功能的有效成分,營養(yǎng)保健價值很高[4-6]。建立大棗中多糖含量的測定方法,不僅可作為評價指標(biāo)的參考,還能更好地進(jìn)行質(zhì)量控制。作者通過大量實驗確定了大棗中多糖的提取方法,并采用苯酚-硫酸顯色法[7]測定了不同產(chǎn)地大棗中多糖的含量。
VIS-723G型可見光分光光度計;HC-2518型離心機(jī);KQ5200V型超聲波清洗器。
葡萄糖對照品[8],105℃干燥恒重,其他試劑均為分析純。乙醇溶液(80%):20 mL蒸餾水中加入無水乙醇80 mL,混勻。氫氧化鈉溶液(100 g·L-1):稱取100 g氫氧化鈉,加蒸餾水溶解并稀釋至1 L,加入固體無水硫酸鈉至飽和,備用。銅儲備液:取0.3 g硫酸銅 (含5個結(jié)晶水),3 g檸檬酸鈉,加水溶解并稀釋至100 mL,混勻。銅試劑溶液:精密吸取銅儲備液50 mL,精密加入蒸餾水50 mL,混勻后加入固體無水硫酸鈉12.5 g并使其溶解,臨用時新配。洗滌劑:移取蒸餾水50 mL,加入10 mL氫氧化鈉溶液,混勻。硫酸溶液(10%):取100 mL濃硫酸加入到800 mL蒸餾水中,混勻,冷卻后稀釋至1 L。苯酚溶液(50 g·L-1):取苯酚100 g,蒸餾,收集180~182℃餾分。稱取精制苯酚5.0 g,加水溶解并稀釋至100 mL,混勻,溶液置冰箱中可保存1個月。
大棗樣品共收集了8種,分別為忻州大棗、呂梁玉喜大棗、呂梁灘棗、呂梁臨縣大棗、呂梁小棗、柳林大棗、保德貢棗、永和大棗。
2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:精密稱取無水葡萄糖對照品0.500 4 g,加水溶解,并定容至50 mL,混勻,置冰箱中保存。此溶液每1 mL含10.0 mg葡萄糖。
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液:吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.00 mL,置于100 mL容量瓶中,加蒸餾水至刻度,混勻,置冰箱中保存。此溶液每1 mL含葡萄糖0.1 mg。
2.1.2 加熱時間的確定 精密移取5份配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0.6mL和5份蒸餾水1.4 mL,分別混合,各加入配好的苯酚溶液1 mL,混勻,再各加濃硫酸10 mL,搖勻后靜置5 min,然后置沸水中分別加熱2,5,8,10,15 min,取出后放置10 min,根據(jù)掃描的吸收曲線,選擇在490 nm測定吸光度,分別為0.197,0.305,0.213,0.247,0.196,結(jié)果表明當(dāng)加熱5 min時吸光度最大,故確定加熱時間為5 min。
2.1.3 濃硫酸用量的確定 精密移取3份配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0.6 mL和3份蒸餾水1.4mL,分別混合,各加入配好的苯酚溶液1 mL,混勻,分別加濃硫酸5,8,10 mL,搖勻后靜置5 min,然后置沸水浴中加熱5 min,取出后放置10 min,根據(jù)掃描的吸收曲線,選擇在490 nm測定吸光度,分別為0.309,0.387,0.306,結(jié)果表明當(dāng)加入濃硫酸8 mL時吸光度值最大,故確定濃硫酸用量為8 mL。
2.1.4 最大吸收波長的確定 精密吸取配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0.6 mL和蒸餾水1.4 mL,混合,加入配好的苯酚溶液1 mL,混勻,精密加入濃硫酸8 mL,充分混勻后靜置5 min,然后置沸水中加熱5 min,取出后放置10 min,用分光光度計在400~650 nm波長處以試劑空白溶液為參比,1 cm玻璃比色皿測定吸光度值。根據(jù)掃描的光吸收曲線顯示其最大吸收波長為488.5 nm。
2.2.1 樣品的提取 稱取大棗樣品1.5 g,加溶劑(蒸餾水)10 mL,微波加熱50 s,過濾后將樣品提取液定容至10 mL,供沉淀粗多糖。
2.2.2 沉淀粗多糖 精密吸取樣品提取液1.5 mL,置于50 mL離心管中,加入無水乙醇6 mL,混勻后,以3 000 r·min-1離心5 min,棄去上清液。殘渣用80%乙醇溶液數(shù)毫升洗滌,離心后棄上清液,反復(fù)3~4次操作,殘渣用蒸餾水溶解并定容至5.0 mL,混勻后,供沉淀葡萄糖。
2.2.3 沉淀葡聚糖 精密吸取上述溶液2 mL置于20 mL離心管中,加入100 g·L-1氫氧化鈉 2.0 mL,銅試劑溶液2.0mL,沸水浴中煮沸2min,冷卻后以3 000 r·min-1離心5 min,棄去上清液。殘渣用洗滌液數(shù)毫升洗滌,離心后棄去上清液,反復(fù)3次操作后,殘渣用10%硫酸溶液2.0 mL溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度,混勻。此溶液為樣品測定液。
2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使 用 液:0,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20 mL(相當(dāng)于葡萄糖 0,0.010,0.020,0.040,0.060,0.080,0.100,0.120 mg)分別置于25 mL比色管中,準(zhǔn)確補蒸餾水至2.0 mL,加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL,混勻后,小心加入濃硫酸8 mL,混勻后,置沸水浴中煮沸5 min,放置10 min后用分光光度計在488.5 nm波長處,以試劑空白為參比,1 cm比色皿測定吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為Y=5.143 4X-0.001 5,r=0.999 2,葡萄糖在0.010~0.120 mg線性關(guān)系良好。
2.3.2 重復(fù)性試驗 按2.2項下方法,制備6份呂梁小棗的樣品溶液,測定吸光度,計算RSD=2.62%。結(jié)果表明測定方法的重復(fù)性良好。
2.3.3 精密度試驗 連續(xù)5次測定柳林大棗樣品的吸光度,計算RSD=0.26%,結(jié)果表明方法精密度良好。
2.3.4 穩(wěn)定性試驗 分別在10,20,30,60,90,120 min測定柳林大棗樣品的吸光度,計算RSD=0.67%,結(jié)果表明供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.3.5 回收率試驗 取已知含量的臨縣大棗約1.5g,精密稱定6份,分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液 (10 mg·mL-1)1mL,按2.2項下方法操作,分別測定,計算回收率,結(jié)果見表1。
表1 葡萄糖加樣回收率試驗
精密吸取不同產(chǎn)地大棗樣品測定液2.0 mL置于25 mL比色皿中,加入50 g·L-1苯酚溶液 1.0 mL,混勻后,小心加入濃硫酸8 mL混勻,置沸水浴中煮沸5 min,放置10 min后用分光光度計在488.5 nm波長處,以試劑空白為參比,用1 cm比色皿測定吸光度值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)葡萄糖的濃度,而后計算出多糖含量。多糖含量結(jié)果計算公式為:
式中:W1—樣品測定液中葡聚糖的質(zhì)量(g)
W2—樣品空白液中葡聚糖的質(zhì)量(g)
V1—粗多糖溶液體積(mL)
V2—沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液體積(mL)
V3—樣品測定液總體積(mL)
V4—測定用樣品測定溶液體積(mL)
V—樣品提取液總體積(mL)
M—樣品量(mL)
m—樣品的質(zhì)量(g)
不同產(chǎn)地大棗中的多糖含量測定結(jié)果見表2。
表2 不同產(chǎn)地大棗中的多糖含量
通過實驗分別比較了超聲提取和微波提取兩種方法。超聲提取分別考察了超聲時間和次數(shù),選擇超聲10,20,30,40 min,結(jié)果超聲 20 min時,吸光度最大;分別超聲1、2、3次,每次20 min,結(jié)果表明超聲兩次后基本能把多糖提取完全。微波提取考察了提取時間,分別加熱 10,20,30,40,50,60 s,結(jié)果表明微波加熱50 s時吸光度最大。通過超聲提取及微波提取多糖的結(jié)果比較,樣品的提取選擇微波加熱,加熱時間為50 s。
實驗結(jié)果顯示,忻州大棗的多糖含量最高,為1.37%;呂梁臨縣大棗的多糖含量最低,為0.66%;表明不同產(chǎn)地的大棗中多糖含量差異較大。
上述實驗確定的大棗中多糖的提取方法及苯酚-硫酸法測定大棗中多糖含量的方法操作簡單、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可用于大棗中多糖含量的測定和大棗的質(zhì)量控制。
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Determination of Polysaccharide in Ziziphus jujube Mill.from Different Places
LIU Xiao-fang,LIU Yang-qing,HAN Xue,JIAO Jian-hua,CHEN Yuan-yuan
(ShanxiCollegeofTraditionalChineseMedicine,Taiyuan030024,China)
Objective:To establiash the method for the extraction and determination of the content of polysaccharide inZiziphusjujubeMill..Methods:Phenol-sulfueic acid method and spectrophotometry were used to determine the content of polysaccharide inZiziphus jujubeMill..The different extracting methods and the main factors effecing color reaction were investigated.Results:The contentof polysaccharide inZiziphusjujubeMill.from different places was different.Conclusion:Themethod that the content of polysacchride determined was showed advantages of simplicity of operation,system accuracy,high precision and reproducibility and can be used for the quality control ofZiziphus jujubeMill..
ZiziphusjujubeMill.;Polysaccharide;Spectrophotometry;Phenol-sulfuric acidmethod;Quality control
山西省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)項目(200652)
*劉養(yǎng)清,教授,Tel:(0351)2272085,E-mail:soh2004@163.com
2011-01-24)