孔令芳，朱紅瓊，楊曉霞

（大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

重金屬鉛和汞對蠶豆根尖細胞的微核效應(yīng)

孔令芳，朱紅瓊，楊曉霞*

（大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

以蠶豆根尖為試材，不同濃度的醋酸鉛和氯化汞為受檢物，探討重金屬Pb2+和Hg2+對蠶豆根尖細胞的微核效應(yīng)。結(jié)果表明：Pb2+和Hg2+均能誘發(fā)蠶豆較高的微核率，且微核率隨溶液濃度升高而增加，但當高于一定濃度后，微核率反而有下降的趨勢。因此，蠶豆可以作為快速檢測環(huán)境中Pb2+和Hg2+遺傳毒性的材料。

鉛離子；汞離子；蠶豆根尖細胞；微核千分率

微核試驗是以動植物為材料，利用細胞生物學(xué)方法通過對其微核率的觀察來表示動植物受遺傳損傷程度的一種方法〔1〕。微核的形成是細胞受誘變劑作用后的一種遺傳學(xué)終點〔1-2〕。

蠶豆根尖細胞微核試驗（micronucleustest, MC-NT）技術(shù)是一種以染色體斷裂及紡錘絲損傷為測試終點的植物微核檢測方法〔3〕。自Degrassi〔1〕等首先利用蠶豆根尖微核試驗建立了誘變劑對蠶豆根尖微核監(jiān)測系統(tǒng)以來，該技術(shù)深受人們重視。此技術(shù)作為一項生物監(jiān)測技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于水體、土壤和空氣等環(huán)境污染的監(jiān)測，并于1986年被列入國家生物監(jiān)測技術(shù)規(guī)范（水環(huán)境部分），用于監(jiān)測水體污染〔1，4-10〕。

鉛和汞是眾多重金屬中常見的兩種，其中汞是最具危險性的有毒有害元素之一。其主要污染源是工業(yè)用鉛和汞的散失、燃煤中鉛和汞的排放、垃圾焚燒和汽車尾氣排放等〔11-12〕。排入生態(tài)系統(tǒng)的污染物會引起生物細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的改變，影響細胞正常的生理、生化等代謝活動的有序進行〔12〕。

本試驗擬通過對蠶豆根尖細胞分裂后微核數(shù)量的計算，監(jiān)測鉛和汞對環(huán)境的污染程度，即驗證微核測定技術(shù)及其作為一種環(huán)境致突變性的檢測手段的廣泛應(yīng)用性。

1 材料與方法

供試植物材料為云南大理市售蠶豆。用蒸餾水將分析純醋酸鉛配制成0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、500.0 mg/L、分析純氯化汞配制成0.01、0.05、0.10、1.00、3.00、6.00 mg/L各6種不同質(zhì)量濃度的溶液，蒸餾水做陰性對照。

1.1 蠶豆浸種、催芽 選取籽粒飽滿、大小一致的蠶豆種子洗凈后，放入盛有蒸餾水的大燒杯內(nèi)，浸泡約24 h，期間換水1～2次。待種子充分吸脹后，將其放入鋪有一薄層濕潤脫脂棉的解剖盤中，置于（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)2～3 d，期間換水4～6次，使其長出1.5～3.0 cm長的初生根。

1.2 染毒處理 選取發(fā)育良好、根長基本一致的蠶豆種子，每13～16粒一組（隨機組合），放入盛有不同質(zhì)量濃度的Pb2+和Hg2+溶液的大培養(yǎng)皿中直接染毒，被測液浸沒根尖即可。染毒處理24 h，同時選用蒸餾水作陰性對照。

1.3 修復(fù)培養(yǎng) 將處理過的種子用蒸餾水浸洗2次，每次5～10 min后，再放入新鋪好的濕潤脫脂棉的解剖盤（或培養(yǎng)皿）內(nèi)，按前述培養(yǎng)條件使根尖細胞修復(fù)培養(yǎng)22～24 h。

1.4 材料固定 取修復(fù)培養(yǎng)后不同處理組的種子，從根尖頂端用剪刀剪下幼根1㎝左右，立即用卡諾氏固定液（3份無水乙醇加1份冰醋酸）固定24 h。將固定后的根尖換入70%乙醇溶液，置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 解離 用蒸餾水清洗固定好的幼根1～2次，每次3～5 min后吸凈蒸餾水，用1 mol/L的鹽酸在50℃恒溫水浴中解離5～20 min，至幼根軟化即可。

1.6 染色和制片 將解離后的根尖吸去鹽酸，用蒸餾水漂洗數(shù)次后置于載玻片上，從根冠起切取根尖1～1.5 mm的分生組織，將其搗碎，加1～2滴Gi?emsa染液，染色10～15 min，蓋上蓋玻片輕輕敲打使根尖細胞分散良好。每種處理的材料各做10～14個根尖壓片。

1.7 鏡檢 制好的壓片置于顯微鏡下檢查，選擇其中細胞較分散，染色效果明顯的6個壓片進行計數(shù)。在40×10倍顯微鏡下觀察，選其根尖分生區(qū)良好的區(qū)域并統(tǒng)計不少于1 000個細胞中微核數(shù)，測定其微核千分率和污染指數(shù)（PI），并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

微核千分率=微核數(shù)/觀察統(tǒng)計的細胞總數(shù)× 1 000‰。

PI＝樣品實測微核千分率的平均值/對照組微核千分率。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸鉛對蠶豆根尖細胞微核發(fā)生率的影響不同質(zhì)量濃度的醋酸鉛溶液處理后，蠶豆根尖細胞有絲分裂不同時期均可產(chǎn)生微核，包括單微核和雙微核（見圖1）。

圖1 重金屬Pb2+對蠶豆根尖細胞微核的影響

表1 不同質(zhì)量濃度的Pb2+、Hg2+對蠶豆根尖細胞微核率的影響

不同質(zhì)量濃度的Pb2+對蠶豆根尖細胞微核率及污染指數(shù)（PI）的影響見表1。

由表1可見：醋酸鉛能誘發(fā)較高頻率的微核，6個不同質(zhì)量濃度的醋酸鉛溶液所誘發(fā)的微核率與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。由此可見：Pb2+對蠶豆根尖細胞具有較大的遺傳毒害作用。在0.1～10.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，微核率隨醋酸鉛濃度的升高而增加，在50.0 mg/L質(zhì)量濃度時微核率最高（27.73±0.93）；當醋酸鉛溶液濃度超過50.0 mg/L時，微核率反而下降。這可能是由于過高濃度的Pb2+溶液引起蠶豆根尖細胞的亞致死性傷害，進而引起細胞反應(yīng)性降低，或抑制了細胞有絲分裂，甚至造成細胞的死亡，從而最終造成其細胞微核率反而下降的趨勢。

而PI的變化與微核率保持一致，總體趨勢是隨醋酸鉛濃度的升高而增加。當醋酸鉛溶液質(zhì)量濃度在50.0 mg/L時，PI達3.82。

2.2 氯化汞對蠶豆根尖細胞微核發(fā)生率的影響不同質(zhì)量濃度的氯化汞溶液處理后，蠶豆根尖細胞有絲分裂不同時期均可產(chǎn)生微核，包括單微核和雙微核（見圖2）。

圖2 重金屬Hg2+對蠶豆根尖微核的影響

不同質(zhì)量濃度的Hg2+對蠶豆根尖細胞微核率及污染指數(shù)的影響見表1。

由表1可見：氯化汞也能誘發(fā)較高頻率的微核，6個不同質(zhì)量濃度氯化汞所誘發(fā)的微核率與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。由表1可知：低濃度的Hg2（+0.01 mg/L）能誘發(fā)較高的微核率，Hg2+對蠶豆根尖細胞具有較大的遺傳毒害作用。在0.01～0.10 mg/L濃度范圍內(nèi)，微核率隨氯化汞質(zhì)量濃度的升高而增加，在1.00 mg/L時微核率最高（22.75±0.86）；當氯化汞溶液的質(zhì)量濃度超過1.00 mg/L時，微核率反而下降，當濃度為6.00 mg/L時，其微核率與對照組（蒸餾水處理）相差最小。這可能是由于過高濃度的Hg2+離子引起蠶豆根尖細胞的亞致死性傷害，進而引起細胞反應(yīng)性降低或抑制了細胞有絲分裂，甚至造成細胞死亡，從而最終引起其細胞微核率下降。其PI的變化與微核率仍保持一致，隨氯化汞溶液質(zhì)量濃度的升高而增加。當氯化汞溶液質(zhì)量濃度在1.00 mg/L時，PI達3.13。

3 結(jié)論與討論

細胞質(zhì)中的微核來源有二：一是斷片或無著絲粒染色體環(huán)在細胞分裂后期不能定向移動，遺留在細胞質(zhì)中；二是有絲分裂的作用使個別染色體或帶著絲粒的染色體環(huán)和斷片在細胞分裂后期被留在細胞質(zhì)中〔13〕。微核率的大小可以直接表征染色體DNA受損傷程度〔14〕。通過不同濃度的醋酸鉛和氯化汞對蠶豆根尖細胞誘導(dǎo)的微核效應(yīng)的試驗，結(jié)果表明：較低質(zhì)量濃度的醋酸鉛（0.1 mg/L）和氯化汞（0.01 mg/L）能極顯著地誘發(fā)蠶豆根尖微核的形成，且醋酸鉛和氯化汞的劑量與蠶豆根尖細胞微核率之間存在一定的劑量——反應(yīng)關(guān)系。

在本試驗中，誘發(fā)最大微核率離子溶液的質(zhì)量濃度，Hg2+＜Pb2（+Hg2+誘發(fā)最大微核率（22.75±0.86）時的質(zhì)量濃度為1.0 mg/L，而Pb2+誘發(fā)最大微核率（27.73±0.93）時的質(zhì)量濃度為50.0 mg/L）；在兩溶液的質(zhì)量濃度相同（均為0.1 mg/L或1.0 mg/L）時，氯化汞對蠶豆根尖細胞微核的誘發(fā)率大于醋酸鉛（濃度為0.1 mg/L時，氯化汞誘發(fā)的微核率為19.50± 0.71，醋酸鉛為14.90±1.03；濃度為1.0 mg/L時，氯化汞誘發(fā)的微核率為22.75±0.86，醋酸鉛為18.57± 0.51）。由此可見，氯化汞的遺傳毒性大于醋酸鉛。

蠶豆根尖微核技術(shù)應(yīng)用的一個主要領(lǐng)域就是檢測水體的致突變性，在自然水體方面，引入PI概念后，把微核率與污染程度聯(lián)系起來，根據(jù)測試水樣微核率與自來水對照，確定污染指數(shù)，再根據(jù)污染指數(shù)的大小進行水體污染分區(qū)。根據(jù)《環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》，0.00＜PI≤1.50時，為基本無污染，1.50＜PI≤2.00時，為輕度污染，2.00＜PI≤3.50時，為中度污染，PI＞3.50時，為重度污染。

蠶豆是微核技術(shù)檢測常用的材料，通過醋酸鉛和氯化汞對蠶豆根尖誘導(dǎo)的微核效應(yīng)試驗，可了解到排入生態(tài)系統(tǒng)中的微量鉛和汞（尤其是汞，極小劑量的汞就能引起較高微核效應(yīng)的產(chǎn)生）對植物及人體存在的潛在遺傳危害，并由此推論排入生態(tài)系統(tǒng)中的微量鉛和汞可能有致突變作用，會對人體或其他生物體造成危害。

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MCN Effects of the Heavy Metal ions Pb2+and Hg2+on the Vicia faba Root Cell

KONG Lingfang,ZHU Hongqiong,YANG Xiaoxia*
（College of Agriculture and Biology Science,Dali University,Dali,Yunnan 671003,China）

Micronucleus effects of the heavy metal ions Pb2+and Hg2+on Vicia faba root cells were investigated with different concen?trations of lead acetate and mercuric chloride.The results showed that within certain range of concentrations,both Pb2+and Hg2+can in?duce high micronucleus frequency（MCNF）of Vicia faba root cells with a dose dependent manner,however,MCNF was found not to in?crease in a linear pattern with high Pb2+and Hg2+concentration.So Vicia faba could be used as the material for fast detection of the genotoxicity of Pb2+and Hg2+in enviroment.

Pb2+;Hg2+;Vicia faba root cells;MCNF

Q336［文獻標志碼］A［文章編號］1672-2345（2011）04-0051-03

2011-01-17

孔令芳,助教，主要從事園林植物與觀賞園藝研究.

*通信作者：楊曉霞，教授，E-mail:dlxy-yxx@163.com.

（責(zé)任編輯 李 明）