馮玲楓，翁美婭，田富饒，陳建華

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004;2.浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310027)

浙江省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(2006C13012)

*馮玲楓，E-mailfeng0032@126.com；*陳建華，E-mailsky78@zjnu.cn

11種鐵線蓮屬藥用植物地上部分總黃酮含量比較研究△

馮玲楓1*，翁美婭1，田富饒2，陳建華1*

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321004;2.浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州310027)

目的對(duì)產(chǎn)自浙江省的11種鐵線蓮屬藥用植物的莖、葉中總黃酮含量進(jìn)行測定分析,試圖發(fā)現(xiàn)鐵線蓮屬植物地上部分總黃酮含量較高的具體種類及鐵線蓮屬植株中總黃酮含量較高的部位。方法以蘆丁為標(biāo)品，采用紫外分光光度法。結(jié)果(1)蘆丁對(duì)照品在15.936～47.808μg·mL-1(r=0.9999)線形關(guān)系良好，平均回收率為100.8%，RSD=1.74%。(2)總黃酮含量總體趨勢為葉>莖，鐵線蓮屬植物葉中總黃酮平均含量為2.636%，莖中總黃酮平均含量為0.617%。(3)總黃酮含量最高的為女萎葉，達(dá)5.581%，最低為湖州鐵線蓮莖，僅0.195%。(4)鐵線蓮屬植物不同物種的總黃酮含量差異顯著，同一物種不同部位間的總黃酮含量也存在一定的差異。(5)聚類分析表明，鐵線蓮屬地上部分總黃酮含量和該屬植物系統(tǒng)演化有一定的相關(guān)性。結(jié)論研究表明女萎、山木通地上部分較適合用作黃酮類藥物開發(fā)，該研究同時(shí)將為鐵線蓮屬不同藥用種類、不同藥用部位及藥用植物親緣關(guān)系的深入研究提供參考依據(jù)。

鐵線蓮屬；藥用植物；地上部分；總黃酮；系統(tǒng)演化

毛茛科鐵線蓮屬(ClematisL.)植物資源豐富，全世界約有355種,主要分布于熱帶和亞熱帶，中國大約有150種[1-2]，其中約85種可作藥用[3]。鐵線蓮屬植物具有鎮(zhèn)痛、抗菌、消炎和抗癌等多種藥理活性。鐵線蓮屬植物的藥理作用與其化學(xué)成分相關(guān)，鐵線蓮屬植物化學(xué)成分復(fù)雜，主要為皂苷類、黃酮類、木脂素。此外還包括揮發(fā)油、特有成分及花色苷、香豆素、生物堿、有機(jī)酸類、烷烴等其他化合物[4]。我國鐵線蓮屬植物資源豐富，因此有必要進(jìn)一步拓展其研究范圍，為其藥用植物資源的開發(fā)利用提供新的理論依據(jù)。

黃酮類化合物廣泛存在于自然界中，是植物在長期自然選擇過程中產(chǎn)生的一些次級(jí)代謝產(chǎn)物，有10多個(gè)類別，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)4000余種黃酮類化合物[5]，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)中[6]。黃酮類化合物具有抗氧化、消除自由基[7-8]、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)[9-10]、抗癌防癌[11-12]、抗炎免疫及抗衰老[13]等功效，還具有吸收紫外輻射、止咳、祛痰、瀉下、解痙、提高記憶力、抗過敏、活血化瘀、利膽及肝臟保護(hù)作用等[14]。

董彩霞等[15]從棉團(tuán)鐵線蓮(Clematishexapetala)干燥根及根莖中分離鑒定了12個(gè)黃酮類化合物。孫鳳等[16]從圓錐鐵線蓮(C.terniflora)全草中分離得到多種黃酮類化合物。古麗巴哈爾·阿巴拜克力[17]對(duì)西伯利亞鐵線蓮(C.sibirica)地上部分有效成分分析及總黃酮的測定證明不同部位均含有黃酮類化合物，且其含量均比較高。古麗巴哈爾·阿巴拜克力等對(duì)新疆粉綠鐵線蓮(C.glauca)不同部位總黃酮含量比較研究也證明了不同部位的黃酮的存在[18]。

《中國藥典》[19]收載源自鐵線蓮屬植物的中藥主要有川木通和威靈仙，傳統(tǒng)藥用部位為根、根莖或莖，考慮到鐵線蓮屬不同藥用部位的開發(fā)利用和鐵線蓮屬植物資源利用率的進(jìn)一步提高，本研究對(duì)浙江產(chǎn)11種鐵線蓮屬藥用植物地上部分(莖和葉)總黃酮含量分別進(jìn)行了測定，為鐵線蓮屬不同藥用種類、不同藥用部位及藥用植物親緣關(guān)系的深入研究提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

YP3001N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Spectrum752PC全波長掃描-紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；蘆丁對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：10080-200707，純度92.5%，供紫外法測定)；其余試劑為分析純。

圓錐鐵線蓮(C.terniflora)、毛蕊鐵線蓮(C.lasiandra)、單葉鐵線蓮(C.henryi)、威靈仙(C.chinensis)、毛果揚(yáng)子鐵線蓮(C.puberulavar.tenuisepala)、鈍齒鐵線蓮(C.apiifoliavar.argentilucida)、柱果鐵線蓮(C.uncinata)、女萎(C.apiifolia)、山木通(C.finetiana)、毛果鐵線蓮(C.peteraevar.trichocarpa)采集地均為金華北山，湖州鐵線蓮(C.huchouensis)采集地為湖州市郊。以上實(shí)物材料均經(jīng)浙江師范大學(xué)陳建華教授鑒定，部分樣品得到中國科學(xué)院植物研究所李良千研究員核定，憑證標(biāo)本存放于浙江師范大學(xué)植物標(biāo)本室中。

2 方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱取對(duì)照品蘆丁9.96mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，冰箱內(nèi)保存，備用。

2.2樣品溶液的制備

將新鮮材料洗凈、烘干，藥材粉碎成粉末，精密稱取2.000g，置索氏提取器中，加適量乙醚提取至無色，棄去醚液，藥渣揮去乙醚，加適量甲醇繼續(xù)提取至無色，將提取液轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得[20-21]。

2.3兩種顯色劑考察[22-23]

2.3.1 10 %三氯化鋁方法顯色 選取圓錐鐵線蓮葉和單葉鐵線蓮為代表，吸取1.0 mL樣品溶液，加1.0 mL 10 %三氯化鋁，用甲醇定容至25 mL，搖勻，靜置15 min后，以相應(yīng)試劑為空白，測吸光度A，測得全波長掃描圖；吸取蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液4.0 mL，采用10 %三氯化鋁方法顯色，測得全波長掃描圖譜，見圖1。結(jié)果顯示3個(gè)圖譜中最大吸收波長的重疊性不好，說明這種顯色方法不合適。

2.3.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH方法顯色 選取圓錐鐵線蓮葉和單葉鐵線蓮為代表，吸取1.0 mL樣品溶液，加水至6.0 mL，加1.0 mL 5 %NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min后，加1.0 mL 10 %Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min后，再加10.0 mL 4 % NaOH溶液，用水定容至25.0 mL，搖勻，15 min后，以相應(yīng)試劑為空白測吸光度A，測得全波長掃描圖譜；吸取對(duì)照品蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液4.0 mL，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH方法顯色，測得全波長掃描圖，見圖2。結(jié)果顯示NaNO2-Al(NO3)3-NaOH方法顯色后對(duì)照品和樣品的最大吸收重疊性比較好。

圖1 圓錐鐵線蓮葉、單葉鐵線蓮葉和蘆丁對(duì)照品用10 %三氯化鋁方法顯色后全波長掃描比較圖譜

圖2 圓錐鐵線蓮葉、單葉鐵線蓮葉和蘆丁對(duì)照品用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH方法顯色后全波長掃描比較圖譜

2.4測試波長的選擇

由圖2可知，對(duì)照品溶液和樣品溶液顯色后的最大吸收波長分別是508,502,500nm,因?qū)φ掌啡芤核芨蓴_較樣品少，故選擇對(duì)照品溶液最大吸收波長508nm為測定波長。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL置25mL容量瓶中，加水至6.0mL，先加1.0mL5%NaNO2搖勻，靜置6min后，再加1.0mL10%Al(NO3)3搖勻，靜置6min后，再加10.0mL4%NaOH溶液，用水定容至25mL，搖勻，15min后于508nm處測定吸光度，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，濃度C(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得方程A=0.0115C+0.0034，r=0.9999，表明濃度在15.936～47.808μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.6精密度試驗(yàn)

精密量取4.0mL的對(duì)照品溶液6份，按2.5法測定吸光光度值，結(jié)果RSD=0.58 %。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取干燥圓錐鐵線蓮葉2.000g，按照2.2方法制備供試液和2.5方法測定，首次測定后，每隔10min測定1次，記錄吸光度值，考察其顯色后的穩(wěn)定性。樣品在1.0h內(nèi)穩(wěn)定，RSD=0.83 %。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份干燥圓錐鐵線蓮葉樣品，分別按照2.2方法制備供試液和2.5方法測定，以不加供試液的相應(yīng)溶液作為空白，在波長508nm處測定吸光度值，RSD=0.55 %，說明重復(fù)性良好。

2.9回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的圓錐鐵線蓮葉適量，分別加入高、中、低3種濃度的對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備。按2.5方法操作，測定總黃酮含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 蘆丁加樣回收率試驗(yàn)

2.10 鐵線蓮屬植物不同物種、不同部位總黃酮含量的測定

參照2.2制備鐵線蓮屬植物不同物種、不同部位供試液22份，在508 nm處測定吸光光度值，重復(fù)測定3次，計(jì)算總黃酮含量及RSD。結(jié)果見表2、3。

表2 鐵線蓮屬不同物種、不同部位的總黃酮含量 /%

注：英文字母表示不同物種同一部位的差異顯著性水平(P<0.05)

表3 鐵線蓮屬不同物種、不同部位總黃酮含量雙因素方差分析

注：**表示在α=0.01水平上極顯著差異，A表示不同種類，B表示不同器官

從表2和表3可以看出，11種鐵線蓮屬藥用植物不同部位總黃酮含量趨勢為葉>莖，鐵線蓮屬植物葉總黃酮平均含量為2.636 %，莖中總黃酮平均含量為0.617 %。總黃酮含量最高的為女萎葉達(dá)5.581 %，最低為湖州鐵線蓮莖僅0.195 %。不同物種、同一物種不同部位間總黃酮含量都有相當(dāng)?shù)牟町?。從?可以看出，莖中總黃酮含量，除了圓錐鐵線蓮和鈍齒鐵線蓮差異不顯著，其他種間均差異顯著，變幅為0.195 %～2.027 %,含量最高的為柱果鐵線蓮莖，最低的是湖州鐵線蓮莖；不同種間葉中總黃酮含量差異顯著，變幅為0.387 %～5.58 1%，最高的為女萎葉，最低的為湖州鐵線蓮葉。地上部分總黃酮含量最高的為女萎，達(dá)6.090 %，其次為山木通，達(dá)5.591 %，最低的為湖州鐵線蓮，僅0.582 %?？傮w而言，葉中總黃酮含量高的種，莖的總黃酮含量也相對(duì)較高。

根據(jù)莖、葉中總黃酮含量進(jìn)行聚類分析，分析11種鐵線蓮屬植物在聚類圖上的位置關(guān)系與系統(tǒng)演化上的相關(guān)性，見圖3。

圖3 11種鐵線蓮屬植物地上部分總黃酮含量的聚類分析圖

從圖3可知，在L=0.64處可以明顯區(qū)分出3個(gè)區(qū)域，毛蕊鐵線蓮、圓錐鐵線蓮和單葉鐵線蓮的親緣關(guān)系較近，女萎、山木通、柱果鐵線蓮、鈍齒鐵線蓮、毛果鐵線蓮、威靈仙、毛果揚(yáng)子鐵線蓮的親緣關(guān)系相對(duì)較近，湖州鐵線蓮與其他10種鐵線蓮的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

通過甲醇提取、硝酸鋁顯色、紫外分光光度法測定，分析了鐵線蓮屬藥用植物莖和葉中總黃酮的含量，該方法準(zhǔn)確、快速，操作簡單，重復(fù)性好，適于鐵線蓮屬植物不同種類和不同部位的總黃酮含量測定。

西伯利亞鐵線蓮地上部分的研究表明不同部位黃酮含量相差較大，結(jié)果為葉>果實(shí)>莖的含量[17]。新疆粉綠鐵線蓮不同部位總黃酮含量比較的研究也表明不同部位的黃酮含量存在差異，結(jié)果為葉>花>果實(shí)>莖[18]。本研究以11種浙江產(chǎn)鐵線蓮屬藥用植物莖和葉為材料，研究發(fā)現(xiàn)不同鐵線蓮屬植物、同種不同部位總黃酮含量總體存在顯著差異，葉的總黃酮含量總體大于莖，這和前人的研究結(jié)論大致相似，不同種類和同一種類不同藥用部位間的成分差異應(yīng)主要是遺傳差異引起的。

根據(jù)11種鐵線蓮屬植物莖、葉及地上部分總黃酮含量的聚類分析圖，可把11種鐵線蓮屬植物分為3類：毛蕊鐵線蓮、圓錐鐵線蓮和單葉鐵線蓮聚為一類(Ⅰ區(qū))，女萎、山木通、柱果鐵線蓮、鈍齒鐵線蓮、毛果鐵線蓮、威靈仙、毛果揚(yáng)子鐵線蓮聚為一類(Ⅱ區(qū))，湖州鐵線蓮聚為一類(Ⅲ區(qū))。其中Ⅰ區(qū)主要屬尾葉鐵線蓮組，Ⅱ區(qū)為威靈仙組，Ⅲ區(qū)為鐵線蓮組，與《中國植物志》和王文采院士的觀點(diǎn)基本一致[1-2]，表明鐵線蓮屬地上部分總黃酮含量和該屬植物系統(tǒng)演化有一定的相關(guān)性；另外根據(jù)系統(tǒng)分類學(xué)觀點(diǎn)，圓錐鐵線蓮應(yīng)歸為威靈仙組，但聚類圖顯示圓錐鐵線蓮與毛蕊鐵線蓮、單葉鐵線蓮親緣關(guān)系較近，這值得更深入地研究。

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ComparasiononTotalFlavonoidContentfromAerialPartsof11MedicinalPlantsofClematisL.

FENG Ling-feng1,WENG Mei-ya1,TIAN Fu-rao2,CHEN Jian-hua1

(1.CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China; 2.CollegeofBiomedicalEngineering&InstrumentScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China)

Objective: To find out the species and organs with higher content of total flavonoids in the aerial parts of 11Clematisspecies collected from Zhejiang province.MethodsThe ultraviolet spectrophotometric method was uesd with rutin as standard.Results(1)There was good linearity(r=0.999 9)during the range of 15.936～47.808 μg·mL-1for rutin.The average recovery was 100.8 % and the RSD=1.74 %.(2)The total flavonoids from different parts ofClematisplants were different.The leaves contained more flavone than the stems,respectively the average content of total flavonoids in leaves and stems was 2.636 %,0.617 %.(3)Clematis.apiifolialeaves had the highest total flavonoids,5.581 %,significantly higher than others whileC.huchouensisonly 0.195 %.(4)Analysis showed that the amount of flavone in various plants and organs was significantly different.(5)Cluster analysis showed that there was a certain correlation between content of total flavonoids in the aerial parts of 11Clematisspecies and evolution of this genus.ConclusionThis study suggested that the aerial parts ofC.apiifoliaandC.finetianacould be used as drug development of total flavonoids.And this study provided reference for further research of different species, different parts and phylogenetic correlation from medicalClematisresources.

ClematisL.; Medicinal plants; Aerial parts; Total flavonoids; Phylogenetic correlation

2011-02-18)