饒先軍，劉 升，王則金，馮雙慶，顏麗萍

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002; 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京100097; 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083)

結(jié)球生菜多酚氧化酶動力學(xué)特性研究

饒先軍1，劉 升2，*，王則金1，馮雙慶3，顏麗萍1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002; 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京100097; 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083)

為解決生菜加工貯藏過程中出現(xiàn)的褐變問題，研究了結(jié)球生菜多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)動力學(xué)特性，分析了pH、溫度及底物濃度等因素對PPO活性的影響，建立了結(jié)球生菜褐變的反應(yīng)動力學(xué)方程。結(jié)果表明，結(jié)球生菜最適pH為8.0，最適溫度為40℃。用Michaelis-Menten機(jī)理描述可得結(jié)球生菜PPO相應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)Km= 0.0691mol/L，vmax=26.5957U/min。生菜葉片組織中的PPO活性較強(qiáng)，葉柄和莖部組織中的PPO活性差異不大，均低于葉片組織中的PPO活性，且結(jié)球生菜莖部切口處已經(jīng)發(fā)生褐變的部分PPO活性為6.12U/min，遠(yuǎn)高于沒有發(fā)生褐變的部分。

結(jié)球生菜，多酚氧化酶，褐變，動力學(xué)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮結(jié)球生菜 2009年10月17日采收于北京市順義區(qū)，品種為射手101。

Thermo Fisher高速冷凍離心機(jī)，島津UV-1800紫外可見分光光度計，HANNA HI8418 pH計，Metteler PE360電子天平，北京長風(fēng)HW.SY11-K數(shù)顯恒溫水浴鍋，Eppendorf移液器及一些常規(guī)的實驗設(shè)備。

1.2 實驗方法

1.2.1 PPO粗酶液制備 取新鮮結(jié)球生菜切碎混勻，準(zhǔn)確稱取2.0g置于研缽中，加入少量石英砂和4.0mL預(yù)冷過的50.0mmol/L pH7.0的磷酸緩沖液(PBS)，冰浴研磨勻漿后轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，用6mL上述的PBS沖洗研缽3次，離心(4℃，12000r/min，15min)，取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PPO活性測定 將 50.0mmol/L pH7.0PBS、0.1mol/L的鄰苯二酚溶液，于25℃下保溫10min后，取2.8mL上述保溫過的PBS和0.1mL鄰苯二酚溶液置于石英比色皿中，再迅速加入0.1mLPPO粗酶液，混勻后于398nm波長處測定反應(yīng)體系吸光度A值，每5s記錄一次，共3min，測定重復(fù)3次。以每克樣品(鮮重)吸光度變化值增加1為1個活性單位U，酶活性可以表示為U/min。

1.2.3 pH實驗 分別取2.8mL不同pH的緩沖液(pH=4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，加入0.1mL 0.1mol/L的鄰苯二酚溶液后，再迅速加入0.1mL粗酶液，混勻后在398nm波長條件下測定其吸光度變化值。

1.2.4 溫度實驗 取50mmol/L、1.2.3中測得最適pH的磷酸緩沖液，濃度為0.1mol/L鄰苯二酚溶液分別在0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100℃的環(huán)境中恒溫10min，取出后迅速加入0.1mL粗酶液，混勻后在398nm波長條件下測定其吸光度變化值。

1.2.5 底物濃度實驗 在2.4mL濃度為0.1 mol/L磷酸緩沖液(1.2.3中測得最適pH)中，分別加入濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mol/L的鄰苯二酚溶液0.4mL，然后再分別加入0.2mL PPO粗酶液，迅速搖勻，在398nm波長條件下測定其吸光度變化值，測得粗酶液的活性。

1.2.6 組織定位實驗 結(jié)球生菜分為葉、葉柄、莖三部分，按1.2.1方法制備粗酶液，其中磷酸緩沖液為pH8.0，并按1.2.2方法測定PPO活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對PPO活性的影響

在pH4.0～10.0范圍內(nèi)進(jìn)行酶活性測定，pH對PPO活性的影響如圖1所示。PPO的最適pH因酶和底物的不同而不同，當(dāng)以C6H6O2為底物時，從圖1中可以看出，PPO活性的適宜pH偏堿性，最適pH為8.0左右。當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谠撝禃r，PPO活性呈明顯的下降趨勢，當(dāng)pH升至10.0時，其活性只有最高活性的54.63%;當(dāng)pH降至4.0附近時，其活性僅為最高活性的1.87%，pH越低，酶活性下降越快。PPO是一種含Cu蛋白質(zhì)［3］，其作用機(jī)制是銅的氧化還原作用，在酸性環(huán)境條件下，PPO中的Cu被解離出來，使其活性降低，因而可以防止褐變的產(chǎn)生;在pH大于8的堿性環(huán)境條件下，Cu會解離成不溶性的Cu(OH)2，使其失活，減少褐變產(chǎn)生。因此在生菜加工貯藏過程中可以根據(jù)這一性質(zhì)考慮采取一些相關(guān)措施，如使用食用酸(檸檬酸等)來降低pH，且對酚酶輔基銅離子有螯合作用，抑制酶的活性，也能明顯減少褐變發(fā)生［4］。

圖1 pH對PPO活性的影響

2.2 溫度對PPO活性的影響

將50mmol/L磷酸緩沖液、濃度為0.1mol/L鄰苯二酚溶液分別在0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100℃的環(huán)境中恒溫加熱10min，取出后迅速加入0.1mL粗酶液，混勻后測定其酶的活性。PPO是一種蛋白質(zhì)，不適宜的溫度會破壞其活性部位三維結(jié)構(gòu)的完整性，而這種結(jié)構(gòu)又是保持酶活性的關(guān)鍵因素［5］。溫度對PPO活性有雙重影響，一是溫度升高加快酶催化反應(yīng)速度，二是促使酶蛋白變性，這是兩種對抗反應(yīng)的綜合反應(yīng)。從圖2中可以看出，低溫能抑制PPO活性，當(dāng)溫度在0～40℃條件下，PPO活性隨著溫度的上升而上升，至40℃時達(dá)到最高值;溫度高于40℃時，PPO活性開始下降，60℃時PPO活性只有最大活性的55.3%;當(dāng)溫度升至80℃及以上時，PPO活性基本消失，僅為40℃條件下酶活性的15.53%。

圖2 溫度對PPO活性的影響

2.3 底物濃度對PPO活性的影響

以0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mol/L的鄰苯二酚溶液為底物，研究了25℃、pH8.0條件下不同底物濃度的產(chǎn)物吸光度值隨時間的變化規(guī)律，擬合所得的直線斜率即為反應(yīng)的初速率v。由于該實驗是在敞開的容器中進(jìn)行，O2濃度較大且恒定，故可看成是單底物酶促反應(yīng)，其機(jī)理為:

反應(yīng)速率方程為

從圖3中可以看出，C6H6O2濃度［S］對反應(yīng)初速率影響很大，且在濃度較小時，其變化對反應(yīng)速率的影響呈直線上升趨勢，在濃度較大時，其變化對反應(yīng)初速率影響較小，當(dāng)達(dá)到一定值時趨于穩(wěn)定，即vmax，此時再增加底物濃度也不能使反應(yīng)速率加快，濃度太高反而使反應(yīng)速率下降，這可能是PPO有效活性被結(jié)合后產(chǎn)生的抑制效果，符合上述Michaelis-Menten機(jī)理［6-7］。

圖3 底物濃度對PPO活性的影響

2.4 米氏常數(shù)Km及vmax

由此說明，生菜褐變反應(yīng)動力學(xué)符合米氏方程。

根據(jù)直線斜率與截距，求得反映底物與酶結(jié)合的親和力米氏常數(shù)Km=0.0691mol/L，最大反應(yīng)速率vmax=26.5957U/min。

圖4 結(jié)球生菜米氏方程

2.5 生菜不同部位PPO活性

以結(jié)球生菜葉、葉柄、莖的提取酶液分別與鄰苯二酚反應(yīng)，測得的PPO活性，結(jié)果見圖5。

圖5 結(jié)球生菜不同部位PPO活性

從圖5可知，結(jié)球生菜的葉片組織中PPO活性較高，為11.22U/min，葉柄和莖部組織中的PPO活性分別為葉片的30.75%和22.55%，差異不大，且均低于葉片，但生菜采收后莖部受機(jī)械切割，在貯藏和運輸中其切口處很容易發(fā)生褐變。

2.6 生菜莖部切口處PPO活性

生菜在采收后，由于莖部切口處受到了機(jī)械損傷，在運輸、貯藏和銷售過程中切口處多酚類物質(zhì)極易受多酚氧化酶氧化作用發(fā)生褐變而產(chǎn)生褐色物質(zhì)，影響生菜的外觀品質(zhì)和商品價值。

由表1可以看出，結(jié)球生菜莖部切口處已經(jīng)發(fā)生褐變的部分PPO活性為6.12U/min，遠(yuǎn)高于未發(fā)生褐變處的PPO活性，差異顯著。

表1 生菜莖部切口處PPO活性

3 結(jié)論

3.1 結(jié)球生菜PPO活性適宜pH偏堿性，當(dāng)pH8.0時，其PPO活性最大，為11.22U/min，因此在加工貯藏過程中應(yīng)控制pH，使其pH呈酸性，以減少其褐變的發(fā)生;PPO活性在40℃時最大，為12.94U/min，低溫有利于抑制酶的活性。

3.2 結(jié)球生菜褐變反應(yīng)的動力學(xué)符合米氏方程所描述的單底物酶促反應(yīng)動力學(xué)，其反應(yīng)速率與底物的關(guān)系:

米氏常數(shù)Km=0.0691mol/L;最大反應(yīng)速度vmax=26.5957U/min。

在實際生產(chǎn)中可以采取一些措施避開多酚氧化酶的最適反應(yīng)條件，如采摘、運輸、加工貯藏過程中把生菜盡量控制在低溫的環(huán)境下，或適當(dāng)調(diào)節(jié)(降低)pH。

3.3 結(jié)球生菜中的葉片PPO活性最強(qiáng)，葉柄和莖的PPO活性差異不大，但生菜采收后莖部受機(jī)械切割，在貯藏和運輸中其切口處很容易發(fā)生褐變;結(jié)球生菜莖部切口處已經(jīng)發(fā)生褐變的部分 PPO活性為6.12U/min，遠(yuǎn)高于沒有發(fā)生褐變的部分。

［1］農(nóng)業(yè)部全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站.生菜花椰菜綠菜花生產(chǎn)160問［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［2］廖錫祥.生菜、生菜包、生菜會［J］.烹調(diào)知識，2004 (2):21.

［3］姜邵通，羅志剛，潘麗軍.甘薯中多酚氧化酶活性的測定及褐變控制［J］.食品科學(xué)，2001，22(3):19-21.

［4］鄭寶東，黃杰，鄭金貴，等.建蓮中多酚氧化酶動力學(xué)特性的研究［J］.中國食品學(xué)報，2003，3(3):41-45.

［5］金玉來，錢建亞.甘薯中多酚氧化酶的研究［J］.食品科學(xué)，1991(9):4-9.

［6］王璋.食品酶學(xué)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2002.

［7］Soledad chazarra，et al.Characterization of monophenolase activity of polyphenol oxidase from iceberg lettuce［J］.J Agric Food Chem，1999，47:1422-1426.

Study on the kinetic character of polyphenol oxidase in iceberg lettuce

RAO Xian-jun1，LIU Sheng2，*，WANG Ze-jin1，F(xiàn)ENG Shuang-qing3，YAN Li-ping1
(1.College of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China;2.Beijing Vegetable Research Center Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China; 3.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agriculture University，Beijing 100083，China)

For solving the problem of browning in the process and storage of iceberg lettuce，the Kinetic Character of polyphenol oxidase(PPO)in iceberg lettuce were studied.Analysised the PPO activity in different pH，temperature and substrate concentration，established the kinetic equation of iceberg lettuce browning.The results showed that the optimum pH and temperature of lettuce PPO was 8.0 and 40℃，respectively.The reaction kinetic of enzymatic browning was accordant with michaelis equation，the Kmand vmaxwere 0.0691mol/L and 26.5957U/min，respectively.The PPO activity in iceberg lettuce leaf tissue was very strong，little difference of PPO activity in the organization of petiole and stems，but lower than in the leaf tissue.And the PPO activity was 6.12U/min in iceberg lettuce stems incision which had some browning，much higher than no browning part.

iceberg lettuce;polyphenol oxidase;browning;kinetic

TS255.1

A

1002-0306(2011)09-0080-03

生菜(Lactuca sativa L.)，又名葉用萵苣，包括皺葉生菜、直立生菜、結(jié)球生菜，為菊科萵苣屬一年或兩年生草本植物，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)［1］。生菜屬低糖、低脂肪蔬菜，富含水分，每100g食用部分含水分高達(dá)94%～96%，故生食清脆爽口，特別鮮嫩，每100g食用部分還含蛋白質(zhì)1～1.4g、碳水化合物1.8～3.2g、維生素C10～15mg及一些礦物質(zhì)，生菜還含有蘋果酸和琥珀酸等有機(jī)物質(zhì)以及萵苣素、天冬堿、精油、甘露醇和酶、甲狀腺活動激素等活性物質(zhì)［2］。生菜含有的萵苣素等苦味物質(zhì)有鎮(zhèn)痛催眠作用，并對消化無力、酸度低、便秘、高血壓和心臟病均有治療作用。在日常生活中生菜常在切割后被單獨或同其它蔬菜包裝在一起，是一種即食或配合沙拉食用的綠葉蔬菜。但生菜在加工和貯藏過程由于其含有的多酚氧化酶(PPO)氧化酚類物質(zhì)會形成醌類化合物，進(jìn)一步聚合形成褐色或棕色的聚合物，從而導(dǎo)致生菜切口處變褐變紅，影響生菜的外觀品質(zhì)、營養(yǎng)價值和商品價值。因此，研究生菜PPO動力學(xué)特性，進(jìn)一步采取有效的措施，最大程度地減少其在加工貯藏過程中的褐變，為生菜商業(yè)化加工和貯藏保鮮提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，從而提高農(nóng)民和企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，帶動整個生菜產(chǎn)業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展。

2010-08-20 *通訊聯(lián)系人

饒先軍(1984-)，男，碩士研究生，主要從事食品加工及貯藏的研究。

國家863計劃課題(2008AA100803);國家“十一五”科技支撐項目(2009BADB9B09-6)。