湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院 李 君 李俊雅

河南羚銳制藥股份有限公司 袁德先

南五味子葉綠體DNA的提取

湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院 李 君 李俊雅

河南羚銳制藥股份有限公司 袁德先

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RandomAmplifiedPolymorphic DNA，RAPD）是在DNA水平上進(jìn)行遺傳標(biāo)記的常用分析方法之一。在操作過(guò)程中，DNA的提取質(zhì)量是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果最為關(guān)鍵的因素。本文，筆者在對(duì)五味子進(jìn)行分子生物學(xué)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)南五味子葉中多酚、多糖、蛋白質(zhì)等復(fù)雜的次生、初生代謝物質(zhì)，給葉綠體DNA提取造成很大的影響。因此，本文，筆者對(duì)傳統(tǒng)的葉綠體DNA提取方法進(jìn)行了改良，對(duì)南五味子葉綠體DNA的提取方法進(jìn)行了研究，在確定有效的提取方法并獲得高質(zhì)量的葉綠體DNA后，為下一步優(yōu)選適合的RAPD條件創(chuàng)造了條件。

一、材料與試劑

1.實(shí)驗(yàn)材料。南五味子葉片由貴州GAP基地提供，葉片臨用前先用去離子水浸泡，使其變軟，展開，洗去表面灰塵，然后用酒精棉球擦拭其表面，以達(dá)到滅菌的目的，防止外源性DNA的污染，晾干或用吸水紙吸干備用。

2.試劑。液態(tài)氮，PVP（聚乙烯基吡咯烷酮），提取緩沖液A（50mmol/L Tris-HClpH=3.6，25mmol/L EDTA，1.25mol/L NaCl），提取緩沖液B（50mmol/LTris-HClpH=3.6，25mmol/L EDTA，1.25mol/LNaCl，10mmol/Lβ-巰基乙醇），提取緩沖液C（0.15mol/LNaCl，100mMEDTApH=8.0），提取緩沖液D（50mmol/LTris-HClpH=8.0，25mMEDTA），提取緩沖液E（0.35mol/L 山 梨 醇 ，100mmol/L Tris-HClpH=8.0，5mM EDTA），β-巰基乙醇，MgCl2（1mol/L），10%SDS（十二烷基磺酸鈉），10%十二烷基肌氨酸鈉，蛋白酶K。以上Tris（三（羥甲基）氨基甲烷）、蛋白酶K及RNaseA（核糖核酸酶A）均為上海生工試劑，其他為市售分析純。UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒（SK1203，Sangon）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

在常規(guī)的葉綠體DNA提取方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行方法學(xué)考察。

1.常規(guī)的葉綠體DNA提取方法。取干燥葉片1.5～2g，4℃暗處理過(guò)夜，沖洗干凈，吸干水分，去中脈，剪碎后置勻漿器中，加入5倍體積4℃預(yù)冷的緩沖液A，勻漿；用8～10層無(wú)菌細(xì)布過(guò)濾，濾液于4℃ 2500r·min-1離心10min；棄去上清液；沉淀加入10ml緩沖液B（其中10mmol/Lβ-巰基乙醇用前加入），輕輕懸浮，4℃ 2500r·min-1離心8min；棄上清，沉淀（可用緩沖液B再洗一次）用少量5ml緩沖液C懸浮沉淀，4℃下4000rpm離心10min，此沉淀即為純化的葉綠體。

上述葉綠體沉淀加入50μg蛋白酶K（20mg/ml）和10%的SDS2ml，37℃保溫2h；用等體積的氯仿：異戊醇（24∶1）抽提3次，上清液加1/10體積0.2mol/LNaAc和2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，-20℃放置過(guò)夜；10000rpm離心30min收集沉淀，20ml 70%乙醇沖洗一遍，室溫放置15min，12000rpm離心10min，風(fēng)干，溶于1000μlTE，加入1/100體積的5mg/mlRNA酶，37℃保溫0.5h；再加1/200體積蛋白酶K（10mg/ml），繼續(xù)保溫1h；氯仿：異戊醇（24∶1）抽提后，無(wú)水乙醇沉淀，70%乙醇洗，真空抽干，用50μl去離子水溶解DNA沉淀，-20℃冰箱保存。

2.方法學(xué)考察。在常規(guī)提取方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，見圖1。

方法1。樣品加入10%PVP粉末，在研缽中加提取緩沖液A研磨。

方法2。純化的葉綠體沉淀加入2.5ml緩沖液B（無(wú)β-巰基乙醇），19μlDNaseI，1mlMgCl2（1mol/L）冰浴1h，后加200μl EDTA終止反應(yīng)，離心，棄上清。

方法3。用少量5ml緩沖液C懸浮沉淀，離心，棄上清后加入冷藏的提取緩沖液E懸浮沉淀，冰上放置10min，離心，棄去上清液，沉淀即為純化的葉綠體。

方法4。加入10ml緩沖液D懸浮,加1/20體積10%十二烷基硫酸鈉（SDS），l/5體積10%十二烷基肌氨酸鈉及1/200體積10mg/ml蛋白酶K，充分搖勻，37℃保溫3h，其間不斷輕輕搖勻，其余同常規(guī)的方法。

方法5。加入10ml緩沖液D懸浮,加1/20體積10%十二烷基硫酸鈉（SDS），l/5體積10%十二烷基肌氨酸鈉1/200體積10 mg/ml蛋白酶K，充分搖勻，37℃保溫3h，其間不斷輕輕搖勻，其余同常規(guī)的方法。

方法6。綜合方法1、2、3和5，余下步驟同常規(guī)的提取方法。

方法7。同方法6，接下來(lái)用UNIQ-10柱處理，-20℃冰箱保存。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定南五味子葉綠體DNA的提取方法：

稱取硅膠快速干燥的葉片1.5～2g，4℃暗處理過(guò)夜，沖洗干凈，吸干水分，去中脈，剪碎后置研缽中，加入10%的PVP粉末和冷藏的提取緩沖液A研磨；用8～10層無(wú)菌細(xì)布過(guò)濾，濾液于4℃ 2300r·min-1離心10min；棄去上清液；沉淀加入10ml緩沖液B（其中200μL10mmol/Lβ-巰基乙醇用前加入），輕輕懸浮，4℃ 2300r·min-1離心8min；棄上清，沉淀可用緩沖液B再洗一次；加2.5ml緩沖液B（無(wú)β-巰基乙醇），19μlDNaseI，1mlMgCl2（1mol/L）冰浴1h，后加200μlEDTA終止反應(yīng)，離心，棄上清；加入冷藏的提取緩沖液E，冰上放置10min，4℃，3000r/min離心10min，棄上清，沉淀即為純化的葉綠體，并用分光光度計(jì)測(cè)量上清液；加入10ml緩沖液D懸浮,加1/20體積10%十二烷基硫酸鈉（SDS），l/5體積10%十二烷基肌氨酸鈉，1/200體積10mg/ml蛋白酶K及100μlβ-巰基乙醇，充分搖勻，37℃保溫3h，其間不斷輕輕搖勻；用等體積的氯仿：異戊醇（24∶1）抽提3次，上清液加1/10體積0.2mol/LNaAc和2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，-20℃放置過(guò)夜；12000rpm離心15min收集沉淀，70%乙醇沖洗一遍，室溫放置15min，12000rpm離心10min，風(fēng)干，溶于1000μlTE；加入1/ 100體積的5mg/mlRNA酶，37℃保溫0.5h；加1/200體積蛋白酶K（10mg/ml），繼續(xù)保溫1h；氯仿：異戊醇（24∶1）抽提后，乙醇沉淀，70%乙醇洗，真空抽干，用50μl去離子水溶解cpDNA沉淀；保存于-20℃冰箱保存。

三、結(jié)果與分析

高質(zhì)量的DNA模板是RAPD成功的關(guān)鍵因素之一，因此選用最佳的葉綠體DNA提取及純化方法是實(shí)驗(yàn)成功的根本保證。

電泳檢測(cè)：取10μlcpDNA提取物，在1.2%的瓊脂糖凝膠上用1×TAE電泳緩沖液電泳，0.5ng/mlEB染色，紫外檢測(cè)，拍照。紫外檢測(cè)結(jié)果見圖2。

四、討論

1.目前對(duì)葉綠體DNA的提取多采用蔗糖梯度離心等方法，所提取的葉綠體DNA純度高無(wú)降解是做RAPD等分子標(biāo)記的理想方法，但本文筆者提取葉綠體DNA的方法其效果同樣非常理想。所提取cpDNA在純度完整性上都可以滿足RAPD的要求。

2.在提取cpDNA中分別采用了硅膠快速干燥的材料和新鮮的材料，提取結(jié)果顯示新鮮材料純度高、無(wú)降解，而快速干燥的樣品則有少許降解現(xiàn)象，所以cpDNA提取最好使用新鮮材料。本實(shí)驗(yàn)選擇了采用硅膠快速干燥的葉片提取效果較好，而且采集葉片的方法簡(jiǎn)單易行，比較適合實(shí)驗(yàn)研究。

3.在提取之前先對(duì)葉片進(jìn)行暗處理和潔凈處理，能夠消耗一部分糖類并有效地避免外源性DNA的污染。在分離葉綠體時(shí)，于2300r/min離心，目的是盡量減少細(xì)胞核，但同時(shí)保證盡量多的完整葉綠體。