李彥媚，趙喜紅，徐澤智，徐振波

(1.廣州醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510120; 2.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院綠色化工過程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，湖北武漢 430073; 3.南海水產(chǎn)研究所，廣東廣州 510300; 4.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640; 5.美國(guó)馬里蘭大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)系，馬里蘭 21201)

環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增法的研究和技術(shù)方法

李彥媚1，趙喜紅2，徐澤智3，徐振波4，5，*

(1.廣州醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510120; 2.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院綠色化工過程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，湖北武漢 430073; 3.南海水產(chǎn)研究所，廣東廣州 510300; 4.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640; 5.美國(guó)馬里蘭大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)系，馬里蘭 21201)

核酸擴(kuò)增是生命科學(xué)領(lǐng)域最具價(jià)值的工具之一，在臨床微生物檢測(cè)、傳染性疾病以及基因診斷方面具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法均存在一定的局限性，因此基于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)方法具有廣闊的應(yīng)用前景。環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增法(loop－mediated isothermal amplification of DNA，簡(jiǎn)稱LAMP)是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，由于其特異性和靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷且成本低廉，因此在可預(yù)見的將來，LAMP技術(shù)將在核酸擴(kuò)增領(lǐng)域逐漸取代PCR反應(yīng)，推動(dòng)檢測(cè)技術(shù)向更快捷簡(jiǎn)便，更精確廉價(jià)的方向發(fā)展。

環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增法，核酸擴(kuò)增，臨床檢測(cè)

核酸擴(kuò)增是生命科學(xué)領(lǐng)域最具價(jià)值的工具之一，在臨床微生物檢測(cè)、傳染性疾病以及基因診斷方面具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如常規(guī)培養(yǎng)、血清學(xué)和免疫學(xué)方法(如ELISA)等，均存在一定的局限性，如耗時(shí)較長(zhǎng)、需要配套的儀器設(shè)備、無法解析基因?qū)用娴募膊?如對(duì)病毒的檢測(cè)與分析、分子流行病學(xué)研究以及各種基因疾病如SNP的鑒別等)。因此基于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)方法具有廣闊的應(yīng)用前景，主要方法包括∶核酸序列擴(kuò)增法(nucleic acid sequence－based amplification，NASBA)、自列復(fù)制(self－sustained sequence replication，3SR)、鏈置換擴(kuò)增法(strand displacement amplification，SDA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain Reaction，PCR)以及熒光定量PCR等。但這些方法均在簡(jiǎn)易性、靈敏度、特異性、快速性等方面存在或多或少的缺陷(表1)，因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)易快捷，特異靈敏的核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法成為當(dāng)務(wù)之急。2000年，Notomi等開發(fā)出一種新的環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增法(loop－mediated isothermal amplification of DNA，簡(jiǎn)稱LAMP)［1］，該方法能夠在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增靶序列。LAMP技術(shù)是識(shí)別靶目標(biāo)序列上的6/8個(gè)特異區(qū)域，設(shè)計(jì)4/6條引物;在恒溫條件下，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst酶)，通過形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)及鏈置換，對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行大量擴(kuò)增，形成多種片段的DNA產(chǎn)物。自LAMP方法問世后短短幾年，已被廣泛應(yīng)用于生物安全、疾病診斷、食品分析及環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。該方法在簡(jiǎn)便，快速，特異性和靈敏度方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，其主要流程為∶選擇靶基因作為檢測(cè)對(duì)象－LAMP反應(yīng)的建立及優(yōu)化－LAMP反應(yīng)的實(shí)際應(yīng)用。本文將按照LAMP的流程，分別對(duì)從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到應(yīng)用進(jìn)行綜述，并著重介紹技術(shù)難點(diǎn)及研究經(jīng)驗(yàn)。

表1 不同核酸擴(kuò)增技術(shù)的特性比較

1 檢測(cè)對(duì)象及靶目標(biāo)基因的選擇

要正確地選擇檢測(cè)對(duì)象及其靶目標(biāo)基因，必須對(duì)LAMP的特點(diǎn)，包括其優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)有所了解。首先，LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效率極高，適合用于快速檢測(cè)。由于LAMP反應(yīng)通過形成DNA環(huán)與鏈置換，可在恒溫條件下(60～65℃)進(jìn)行。由于沒有溫度循環(huán)過程中的時(shí)間損失，因此反應(yīng)可在短時(shí)間內(nèi)將少量拷貝的靶基因擴(kuò)增到109～1010水平(DNA濃度約0.4～0.8g/L)。早期的LAMP反應(yīng)過程耗時(shí)約1～2h，但通過對(duì)引物進(jìn)行改進(jìn)，可明顯提高擴(kuò)增效率，縮短反應(yīng)時(shí)間;最顯著的進(jìn)展是通過設(shè)計(jì)環(huán)引物(loop primer)，加速擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，能縮短反應(yīng)時(shí)間至0.5～1h［2］。另外通過優(yōu)化引物不同的濃度配比，也能提高反應(yīng)的擴(kuò)增效率。第二，LAMP反應(yīng)結(jié)果判斷簡(jiǎn)易快速。LAMP反應(yīng)的結(jié)果除可以通過常規(guī)的凝膠電泳結(jié)合成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)外，由于其高效的擴(kuò)增效率，反應(yīng)產(chǎn)物極多，因此還有多種通過直接肉眼觀察從而對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷的方法，使LAMP反應(yīng)更方便快捷與簡(jiǎn)便。但同時(shí)由于反應(yīng)產(chǎn)物并非均一，因此LAMP的應(yīng)用也具有其限制性，包括產(chǎn)物無法用于克隆，檢測(cè)產(chǎn)物無法進(jìn)行深入分析與鑒定等。第三，LAMP反應(yīng)特異性強(qiáng)，靈敏度高，可以取代大多數(shù)PCR檢測(cè)。由于LAMP的特異引物可以嚴(yán)格地識(shí)別靶核酸序列上的6個(gè)特異區(qū)域，通過與該6個(gè)獨(dú)立部位的準(zhǔn)確結(jié)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，因此其特異性極高;即使1個(gè)核苷酸差異，LAMP也能夠區(qū)分相應(yīng)的靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，基于此原理，LAMP可用于SNP的檢測(cè)。另外，LAMP反應(yīng)的靈敏度極高，其靈敏度可達(dá)常規(guī)PCR的10～100倍(檢出限是常規(guī) PCR的1/100～1/10拷貝數(shù))，因此在對(duì)如培養(yǎng)增生耗時(shí)長(zhǎng)(如結(jié)核桿菌)或病毒載量較低(如對(duì)病毒攜帶者)等進(jìn)行檢測(cè)時(shí)具有較大優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，與PCR相似，除可直接對(duì)DNA進(jìn)行檢測(cè)外，還可以通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)，對(duì)RNA模板進(jìn)行檢測(cè)，一般稱之為RT－LAMP;這使其可應(yīng)用于對(duì)RNA病毒的檢測(cè)。綜上，LAMP在檢測(cè)領(lǐng)域內(nèi)可取代大多數(shù)PCR檢測(cè)，并獲得更高的特異性與靈敏度。第四，實(shí)驗(yàn)裝置簡(jiǎn)單，成本較低廉。由于LAMP反應(yīng)在恒溫下就可進(jìn)行，不需要如PCR儀等的溫度循環(huán)設(shè)備。在LAMP反應(yīng)實(shí)際應(yīng)用中，僅需要得到穩(wěn)定熱源的設(shè)備，如普通的恒溫儀或水浴鍋即可。因此LAMP方法具有較大的簡(jiǎn)易性與推廣價(jià)值，尤其適合基層醫(yī)療單位和相對(duì)落后地區(qū)的常規(guī)檢測(cè)應(yīng)用。

綜上，LAMP反應(yīng)具有操作方便，高效快速，靈敏特異和廉價(jià)簡(jiǎn)易等優(yōu)點(diǎn);但同時(shí)也具有僅能用于初篩檢測(cè)(擴(kuò)增產(chǎn)物無法用于克隆及深入分析鑒定)和穩(wěn)定性不高等缺點(diǎn)，因此在選擇檢測(cè)對(duì)象時(shí)需進(jìn)行全面考慮。

2 保守?cái)U(kuò)增序列的選擇

在選擇檢測(cè)對(duì)象及合適的靶基因后，需選取保守的擴(kuò)增區(qū)域，以便進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。在此對(duì)LAMP的引物和反應(yīng)原理進(jìn)行闡述。LAMP技術(shù)通過識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域，分別是 F1/B1，F(xiàn)2/B2和F3/B3，設(shè)計(jì)4條特殊引物。其中兩條為內(nèi)引物FIP (F1c和F2)和BIP(B1c和B2)，F(xiàn)2和B2分別處于擴(kuò)增片段兩端，長(zhǎng)度為18～24bp;F1/B1分別位于F2/B2內(nèi)側(cè)，與其相距30～40bp，長(zhǎng)度與F2/B2相當(dāng)，為18～24bp。另兩條為外引物F3和B3，分別為位于F2和B2外側(cè)，長(zhǎng)度為17～21bp，僅在LAMP反應(yīng)的起始階段起作用。綜上，LAMP引物識(shí)別的區(qū)域約200～250bp，因此用以設(shè)計(jì)的擴(kuò)增區(qū)域應(yīng)至少達(dá)500bp以上。LAMP反應(yīng)過程包括啞鈴狀模板合成階段、循環(huán)擴(kuò)增階段、伸長(zhǎng)和再循環(huán)階段。首先在啞鈴狀模板合成階段，F(xiàn)IP/BIP的F2/B2序列結(jié)合到模板DNA的 F2c/B2c上，通過互補(bǔ)序列配對(duì)，合成DNA鏈，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。然后，通過F3/B3與模板DNA的F3c/B3c區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，合成DNA鏈，啟動(dòng)鏈置換反應(yīng)，擠掉上述由FIP/BIP合成的DNA鏈，而被釋放出的DNA鏈兩端均存在互補(bǔ)序列，發(fā)生自我堿基配對(duì)，通過F1c/B1c和F1/B1互補(bǔ)，形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這時(shí)，被置換下的由FIP/BIP引導(dǎo)的合成鏈兩端自動(dòng)成環(huán)，形成一條兩端環(huán)狀的單鏈，即啞鈴結(jié)構(gòu)。其次，在循環(huán)擴(kuò)增階段，上述形成啞鈴結(jié)構(gòu)的通過自我引導(dǎo)延伸，生成雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu);FIP的F1c結(jié)合到莖環(huán)DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)的F1區(qū)域上，合成DNA雙鏈;這時(shí)形成了一個(gè)過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，在隨后自我引導(dǎo)的鏈置換DNA合成反應(yīng)中生成一條莖環(huán)DNA和互補(bǔ)的DNA鏈。這兩種結(jié)構(gòu)可通過不斷循環(huán)反應(yīng)生成相同的擴(kuò)增產(chǎn)物;而其中間產(chǎn)物則為下一階段形成更大片段擴(kuò)增產(chǎn)物的形成提供模板。最后一步是伸長(zhǎng)和再循環(huán)階段，F(xiàn)IP/BIP結(jié)合到莖環(huán)結(jié)構(gòu)的F1/B1上，通過鏈置換反應(yīng)，不斷合成新的DNA鏈，使莖環(huán)個(gè)數(shù)逐漸增加。LAMP反應(yīng)的關(guān)鍵在于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成與Bst大片段DNA聚合酶作用下的鏈置換，內(nèi)引物FIP/BIP通過結(jié)合到莖環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)狀區(qū)域的互補(bǔ)序列(F1/B1)上，在Bst酶作用下進(jìn)行不斷的鏈置換反應(yīng)，最終形成大量不均一的擴(kuò)增產(chǎn)物，包括上述反應(yīng)形成一系列反向重復(fù)靶序列形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)片段，形成大小相差100bp左右的DNA混合物，電泳后形成典型的梯狀圖。

3 引物的設(shè)計(jì)

LAMP引物的設(shè)計(jì)是整個(gè)反應(yīng)中最關(guān)鍵的步驟。其設(shè)計(jì)方法包括觀察搜索法與軟件設(shè)計(jì)法，傳統(tǒng)的設(shè)計(jì)方法是觀察搜索法，主要基于FIP/BIP中的T－T－T－T序列，在保守?cái)U(kuò)增序列中找到重復(fù)堿基，然后根據(jù)引物設(shè)計(jì)準(zhǔn)則進(jìn)行分析，選擇優(yōu)化的引物對(duì)。成功的引物設(shè)計(jì)包括如下關(guān)鍵因素∶首先，引物間的距離。其中細(xì)則包括∶a.成環(huán)區(qū)，即F2/B2的5'端到B2c/F2c的3'端(外引物F3/B3不參與到主要的環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增反應(yīng))，長(zhǎng)度約為120～180bp;b.環(huán)結(jié)合區(qū)，即F2/B2的5'端到F1c/B1c的5'端，長(zhǎng)度約為40～60bp，其中在F2/B2到F1c/B1c之間的區(qū)域可設(shè)計(jì)環(huán)引物L(fēng)F/LB;c.外引物F3/B3到F2/B2需相隔0～20bp，一般選取12～18bp。第二，Tm值。LAMP引物的退火溫度是引物的重要參數(shù)之一，對(duì)于反應(yīng)的起始和延伸過程都非常重要。總的來說為F1c/B1c＞F2/B2＞F3/B3，其中F2/B2，F(xiàn)3/B3和LF/LB的Tm值比較一致，對(duì)GC含量比較豐富(GC含量大于65%)的模板可取59～61℃，對(duì) AT含量豐富(GC含量小于65%)的可取54～56℃;F1c和B1c的Tm值稍高，對(duì)上述兩種情況分別取64～66℃與59～61℃。第三，引物的穩(wěn)定性。在引物設(shè)計(jì)過程中，需注意避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，尤其是FIP/BIP較長(zhǎng)(約40bp)，可采用基因解析軟件進(jìn)行分析;避免3'末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物間自身的序列互補(bǔ)(如用Primer Explorer軟件設(shè)計(jì)，可通過“dimer check”進(jìn)行確定);末端穩(wěn)定性對(duì)反應(yīng)的順利進(jìn)行也十分重要，其中F2/B2，F(xiàn)3/B3和LF/LB的3'端與F1c與B1c的5'端比較重要(如用軟件設(shè)計(jì)可通過對(duì)各引物末端6堿基的dG值進(jìn)行篩選);相對(duì)來說，F(xiàn)3/B3僅在反應(yīng)啟動(dòng)階段起作用，其重要性相對(duì)較低。第四，GC含量，一般選擇為45%～60%即可。軟件設(shè)計(jì)法主要是通過榮研公司在線的軟件設(shè)計(jì)工具，進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)流程簡(jiǎn)述如下∶首先登錄榮研公司在線軟件設(shè)計(jì)網(wǎng)頁(http∶// primerexplorer.jp/e/)，并選擇軟件版本V3或V 4;輸入模板序列，點(diǎn)擊“Design”，并在系統(tǒng)設(shè)別序列后點(diǎn)擊“Generate”生成引物;然后遵循從粗選到細(xì)選的規(guī)則，在開始的時(shí)候可放松挑選的條件，勾選引物，并可點(diǎn)擊“Detail”查看引物的詳細(xì)數(shù)據(jù);確定所選引物，優(yōu)先選擇所有5’端和3’dG值小于－4的，另外可選擇2～3組，通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步篩選;最后點(diǎn)擊“Primer information”進(jìn)行保存。設(shè)計(jì)環(huán)引物的時(shí)候，在引物設(shè)計(jì)頁面，輸入上述保存的文件，按照相應(yīng)操作，則可生成環(huán)引物。

4 LAMP反應(yīng)的建立與優(yōu)化

4.1 引物的篩選與優(yōu)化

雖然引物經(jīng)過上述方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，但最終對(duì)引物的篩選，需通過實(shí)際LAMP反應(yīng)進(jìn)行。因?yàn)榧词菇?jīng)過嚴(yán)格的引物設(shè)計(jì)程序，并使引物符合所有設(shè)定條件，但仍會(huì)存在一定的問題，分述如下∶a.擴(kuò)增結(jié)果為陰性;根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，即使通過網(wǎng)上軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，并選擇最為優(yōu)化參數(shù)的引物套，但在實(shí)際LAMP反應(yīng)中只有約80%～90%能進(jìn)行擴(kuò)增。b.非常規(guī)擴(kuò)增;不同的引物套具有不同的擴(kuò)增效率，在實(shí)際過程中，我們發(fā)現(xiàn)同一個(gè)LAMP反應(yīng)體系，不同引物使反應(yīng)結(jié)果達(dá)到陽性所需的時(shí)間不同;而通過實(shí)時(shí)濁度計(jì)的擴(kuò)增曲線可見，部分引物為非常規(guī)擴(kuò)增，對(duì)此應(yīng)予剔除。在引物的篩選與優(yōu)化過程中，建議通過實(shí)時(shí)濁度計(jì)并觀察擴(kuò)增曲線，在所設(shè)計(jì)的引物中選擇能特異快速，并符合常規(guī)擴(kuò)增過程的引物套。

4.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化

LAMP體系對(duì)反應(yīng)具有重要影響，一般常規(guī)LAMP體系包括4～6條引物，緩沖液與Bst酶，dNTP，甜菜堿，鎂離子(一般用硫酸鎂)與模板。其中重要的因素包括∶a.反應(yīng)體系大小∶一般選取25或50μL體系，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，12.5μL體系仍能成功進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，但穩(wěn)定性與重現(xiàn)性有所下降。b.引物濃度∶如上述，通過優(yōu)化引物濃度可有效提高擴(kuò)增效率。內(nèi)/外引物的濃度配對(duì)比引物的絕對(duì)濃度要重要，一般選取4∶1或8∶1。c.dNTP∶與PCR相比，LAMP反應(yīng)需更高濃度的dNTP，一般終濃度為1～2mmol/L，常用1.4～1.6mmol/L。由于LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增量是由dNTP決定(而非模板)，因此dNTP的濃度對(duì)反應(yīng)具有重要影響。d.鎂離子∶在LAMP反應(yīng)過程中需加入鎂離子作為緩沖液，與焦磷酸鹽形成沉淀，維持體系穩(wěn)定;常用5～10mmol/L的硫酸鎂。e.甜菜堿∶在體系中加入0.5～1mmol/L甜菜堿有利于維持體系平衡，但其并非LAMP反應(yīng)所必需，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，即使體系中不加入甜菜堿，LAMP反應(yīng)也能進(jìn)行。f.DNA模板∶DNA模板的質(zhì)量與濃度是反應(yīng)順利進(jìn)行的關(guān)鍵因素。在體系優(yōu)化過程中，建議使用質(zhì)量較高的模板DNA，便于提高反應(yīng)的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，從而達(dá)到對(duì)反應(yīng)參數(shù)的掌握。

4.3 反應(yīng)參數(shù)的評(píng)估

LAMP反應(yīng)的主要參數(shù)包括靈敏度和特異性。前者是通過選用不同濃度梯度的模板DNA或檢測(cè)對(duì)象，獲得LAMP所能檢測(cè)的最低檢出值;可用檢測(cè)對(duì)象(如在細(xì)菌中為CFU)或標(biāo)準(zhǔn)DNA量(一般為10～100ng)進(jìn)行表示。后者則通過在不同種屬的檢測(cè)對(duì)象中同時(shí)設(shè)置LAMP反應(yīng)對(duì)照，從而對(duì)LAMP反應(yīng)的特異性進(jìn)行說明。對(duì)陰性對(duì)照樣品檢測(cè)引物特異性時(shí)，需適當(dāng)把反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)(例如增至120min)，一般如沒有出現(xiàn)陽性結(jié)果，則可視為特異;如出現(xiàn)陽性結(jié)果，則考慮重新設(shè)計(jì)引物，甚至更改靶點(diǎn)。

4.4 結(jié)果判定

LAMP反應(yīng)的結(jié)果判定包括實(shí)時(shí)法和終點(diǎn)法。在核酸擴(kuò)增過程中，隨著dNTP的消耗與擴(kuò)增產(chǎn)物的合成，同時(shí)也形成了大量副產(chǎn)物如焦磷酸鎂鹽沉淀。其化學(xué)反應(yīng)式如下∶

由于LAMP反應(yīng)極高的擴(kuò)增效率，因此反應(yīng)過程中產(chǎn)生了大量的焦磷酸根(可達(dá)約10μg)，但PCR反應(yīng)產(chǎn)生的焦磷酸根則不到0.1μmol/L(約0.2μg)，而常規(guī)可檢出的最低濃度是0.5mmol/L(約為4μg)，因此LAMP反應(yīng)通過焦磷酸鎂沉淀量與DNA生成量之間的線性關(guān)系，可對(duì)反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量，而PCR反應(yīng)則需要其他特殊的顯色試劑和酶輔助來檢測(cè)產(chǎn)生的焦磷酸離子。研究表明，焦磷酸鎂沉淀在400nm處有吸收峰，利用LAMP反應(yīng)中焦磷酸鎂沉淀與所合成DNA量之間的線性關(guān)系，通過實(shí)時(shí)濁度儀監(jiān)測(cè)沉淀的形成量，對(duì)反應(yīng)中DNA的合成量進(jìn)行反推，從而對(duì)LAMP可進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和定量［3］。終點(diǎn)法則包括∶a.凝膠電泳∶其中包括直接法和酶切法兩種。由于LAMP反應(yīng)過程擴(kuò)增大量的非單一片段的產(chǎn)物，因此可以通過凝膠電泳直接進(jìn)行檢測(cè);反應(yīng)過程中形成大量不均一條帶，大小相差100bp左右，在膠上能形成梯狀圖，反映了產(chǎn)物的條帶量;酶切法則可以通過直接利用原有的酶切位點(diǎn)，或在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候在TTTT的前后引入酶切位點(diǎn)，通過限制性酶消化來鑒定產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和大小。b.沉淀及熒光判斷法∶其中包括焦磷酸鎂沉淀、鈣黃綠素、Eva Green、SYBR GreenI和HNB等。如上所述，由于LAMP反應(yīng)過程中形成大量焦磷酸鎂沉淀，因此直接通過肉眼觀察是否生成白色的焦磷酸鎂沉淀，從而對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷［1－2，4］。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)小管中加入(1∶100)的SYBR Green I熒光染料。利用熒光染料SYBR Green I與雙鏈DNA結(jié)合會(huì)發(fā)綠色熒光，因此通過向反應(yīng)產(chǎn)物加入稀釋的SYBR Green I(1∶100，約1μL)，如反應(yīng)生成大量的擴(kuò)增產(chǎn)物，則染料顏色由橙色變?yōu)榫G色。通過該顏色變化可對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷，既可在自然光下肉眼觀察，也可在紫外燈下進(jìn)行觀察。但由于SYBR Green I能與所有雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此該顏色變化并非LAMP反應(yīng)特異。而近年來，越來越多的研究報(bào)道選用鈣黃綠素作為熒光染料。

綜上，對(duì)LAMP反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判斷有多種方法，可根據(jù)實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行選擇。

5 LAMP反應(yīng)的實(shí)際應(yīng)用

5.1 模板DNA的獲取

模板DNA是LAMP反應(yīng)順利進(jìn)行的必要因素之一，在優(yōu)化反應(yīng)體系過程中可用質(zhì)量較高的模板DNA，但在實(shí)際應(yīng)用中，出于降低成本與縮短反應(yīng)時(shí)間，因此更傾向于使用簡(jiǎn)易快捷的DNA提取處理方法，從而使模板DNA的質(zhì)量有所下降;同時(shí)，由于DNA處理步驟的減少，因此模板中可能含有大量雜物因子，對(duì)LAMP反應(yīng)的順利進(jìn)行也會(huì)造成一定影響。在實(shí)際應(yīng)用中，需考慮模板DNA的質(zhì)量問題，在保證LAMP反應(yīng)穩(wěn)定性與重現(xiàn)性的前提下，盡量選用簡(jiǎn)易快捷的模板提取和處理方法。

5.2 LAMP反應(yīng)批間穩(wěn)定性與重現(xiàn)性

如上所述，LAMP的其中一個(gè)不足之處是穩(wěn)定性與重現(xiàn)性較PCR差，與Q－PCR相當(dāng)。由于LAMP設(shè)計(jì)過程繁瑣，反應(yīng)過程復(fù)雜，造成其非常規(guī)擴(kuò)增的因素較多，因此其穩(wěn)定性與重現(xiàn)性較差。但通過優(yōu)化引物與緩沖液體系，能顯著提高LAMP反應(yīng)的批間穩(wěn)定性與重現(xiàn)性;在實(shí)際應(yīng)用中，需至少重復(fù)三次反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。

5.3 對(duì)交叉污染的預(yù)防與處理

與所有核酸擴(kuò)增方法相似，LAMP反應(yīng)也存在嚴(yán)重的交叉污染問題，主要集中于擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。由于LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效率高和產(chǎn)物量大(比常規(guī)PCR高10－3～10－4)，因此非常容易出現(xiàn)產(chǎn)物污染，操作稍不注意就會(huì)出現(xiàn)交叉污染，陰性對(duì)照也會(huì)出現(xiàn)陽性結(jié)果;同時(shí)出現(xiàn)污染后較難消除，對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程造成較大影響。對(duì)交叉污染出現(xiàn)的預(yù)防方法最主要是實(shí)驗(yàn)流程的空間隔離，例如按照臨床擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)，把試劑配制，模板處理，擴(kuò)增反應(yīng)與結(jié)果分析在空間上隔離;其次“不開蓋”原則，即在反應(yīng)后不打開蓋子進(jìn)行檢測(cè)，主要通過實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行擴(kuò)增曲線的獲取與分析。在出現(xiàn)交叉污染后，一般對(duì)于污染處理的方法包括∶a.改變擴(kuò)增靶點(diǎn)∶由于LAMP反應(yīng)產(chǎn)物量大，易于造成污染，使引物以污染的產(chǎn)物為模板進(jìn)行大量擴(kuò)增;因此通過改變擴(kuò)增靶點(diǎn)，重新設(shè)計(jì)引物，則原污染產(chǎn)物無法被新引物識(shí)別，從而消除污染現(xiàn)象。b.消除環(huán)境中殘存的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，主要方法包括∶對(duì)環(huán)境進(jìn)行常規(guī)清潔和滅菌殺毒等，包括酒精、DNAZAP等;紫外燈照射，但由于紫外線僅對(duì)小于500bp的DNA片段起作用，而LAMP反應(yīng)后能出現(xiàn)大量大于500bp的產(chǎn)物，因此該方法僅能作為輔助用，并不能徹底解決污染;dUTP/UDG系統(tǒng)，通過UDG酶(0.05U)在一定條件下進(jìn)行消化(37℃，5min)和滅活(92℃，1min)，從而使 dTTP全部為dUTP代替，對(duì)低濃度污染(不大于103copies/mL)可進(jìn)行徹底消除;在一定時(shí)期內(nèi)停止LAMP反應(yīng)，并注意通風(fēng)。

6 結(jié)語

目前，LAMP反應(yīng)在食品安全、公共衛(wèi)生等領(lǐng)域中對(duì)常見食源性中毒細(xì)菌、流行性病毒、基因診斷等多個(gè)方面得到廣泛應(yīng)用［5－13］。由于其特異性和靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷且成本低廉，因此在可預(yù)見的將來，LAMP技術(shù)將在核酸擴(kuò)增領(lǐng)域逐漸取代PCR反應(yīng)，推動(dòng)檢測(cè)技術(shù)向更快捷簡(jiǎn)便，更精確廉價(jià)的方向發(fā)展。

［1］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop－mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28 (12):63.

［2］Nagamine K，Hase T，Notomi T.Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers［J］. Molecular and Cellular Probes，2002(16):223－229.

［3］Mori Y，Nagamine K，Tomita N，et al.Detection of Loopmediated isothermal amplification reaction by tubidity derived from magnesium pyrophosphate formation［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2001，289(1):150－154.

［4］Maruyama F，Kenzaka T，Yamaguchi N，et al.Detection of bacteria carrying thestx2 gene by in situ loop－mediated isothermalamplification［J］.Applied and Environmental Microbilolgy，2003，69(8):5023－5028.

［5］Ohtsuka K，Yanagawa K，Takatori K，et al.Detection of Salmonella enteria in naturally contaminated liquid eggs by loopmediated isothermal amplification and characterization ofSalmonellaisolates［J］.Applied and Environmental Microbilolgy，2005，71:6730－6735.

［6］Pham H M，Nakajima C，Ohashi K，et al.Loop－mediated isothermal amplification for rapid detection of Newcastle disease virus［J］.J Clin Microbiol，2005，(43):1646－1650.

［7］Ihira M，Yoshikawa T，Enomoto Y，et al.Rapid diagnosis of Human Herpesvirus 6 Infection by a novel DNA amplification method，loop－mediated isothermal amplification［J］.J Clin Microbiol，2004，42(1):140－145.

［8］Zhao X，Li Y，Wang L，et al.Development and application of a loop－mediated isothermal amplification method on rapid detectionEscherichia coliO157 strains from food samples［J］.Mol Biol Rep，2010，37:2183－2188.

［9］Zhao X，Wang L，Li Y，et al.Development and application of a loop－mediated isothermal amplification method on rapid detection of Pseudomonas aeruginosa strains［J］.World J Microbiol Biotechnol(DOI 10.1007/s11274－010－0429－0).

［10］Wang L，Shi L，Alam MJ，et al.Specific and rapid detection of food－borne Salmonella by loop－mediated isothermal amplification method［J］.Food Res Int，2008，41:69－74.

［11］Zhao X，Li Y，Chu J，et al Rapid detection ofVibrio parahaemolyticusstrains and virulent factors by loop－mediated isothermalamplification assays［J］ .Food Science and Biotechnology，In press.

［12］Zhao X，Li Y，Chu J，et al.Development and application of a rapid and simple loop－mediated isothermal amplification method for food－borneSalmonelladetection［J］.Food Science and Biotechnology，In press.

［13］王麗.近海食源微生物產(chǎn)毒特性的基因分析及其快速檢測(cè)研究［D］.華南理工大學(xué)，2008.

Development on the techniques of loop－mediated isothermal amplification

LI Yan－mei1，ZHAO Xi－h(huán)ong2，XU Ze－zhi3，XU Zhen－bo4，5，*
(1.Guangzhou Medical College，Guangzhou 510120，China;2.Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education，School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430073，China;3.South China Fishery Institute，Guangzhou 510300，China; 4.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China; 5.Department of Microbial Pathogenesis，Dental School，University of Maryland，Baltimore，Maryland 21201，USA)

Clinical detection based on genetic amplification is one of the most valuable tools in bioscience，which had been proved to be applicable in detection of clinical microbes，infectious diseases and gene diagnosis. Limitation on traditional detection methods posed significant obstacles for their broad application.A novel nucleic acid amplification method，designated loop－mediated isothermal amplification(LAMP)，known as a rapid，lowcost，easy operating，highly sensitive and specific detection method，had been reported and applied in the field of bacteriological detection.In future，it’s convinced LAMP will replace PCR assays，contributing to more rapid，simple，specific and accurate detection methods.

loop－mediated isothermal amplification;nucleic acid amplification;clinical detection

TS201.2+4

A

1002－0306(2011)11－0514－05

2010－09－26 *通訊聯(lián)系人

李彥媚(1982－)，女，碩士研究生，研究方向:臨床基因檢測(cè)。