王巧英，吳冬青，安紅鋼，宋 海，任雪峰

(河西學(xué)院化學(xué)系，甘肅張掖 734000)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化抑制-褪色光度法測定維生素C的條件

王巧英，吳冬青，安紅鋼，宋 海，任雪峰*

(河西學(xué)院化學(xué)系，甘肅張掖 734000)

基于維生素C對羅丹明B和K2S2O8間經(jīng)Ag+催化的褪色反應(yīng)的抑制作用，研究響應(yīng)面分析法優(yōu)化抑制－褪色光度法測定維生素C的條件。在RB的用量、HAc的用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間四個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化抑制－褪色光度法測定維生素C的條件，利用Box－Behnken設(shè)計(jì)模型，研究四個(gè)自變量對該反應(yīng)的影響。結(jié)果表明:該反應(yīng)的最佳條件為，RB的用量6.99mL，HAc的用量2.81mL，溫度為20℃，反應(yīng)時(shí)間11.82min。在此條件下，測得土泡參中VC含量為0.08mg/g。該方法精密度好，RSD(n=5)為0.25%，回收率高，平均回收率為100.97%。

響應(yīng)面法，抑制褪色，VC，條件實(shí)驗(yàn)

抗壞血酸(VC)具有較好的還原性，可用于延長食品保質(zhì)期和調(diào)節(jié)口味，提高人類、魚類的抗病以及皮膚的抗衰老能力［1］。近年來已經(jīng)報(bào)道的測定維生素C的方法有∶滴定法、分光光度法、熒光分光光度法、毛細(xì)管電泳法、原子吸收法、近紅外法、高效液相色譜法［2］、電化學(xué)法、碘量法、酶法［3］等。這些方法表現(xiàn)出靈敏度較低、儀器復(fù)雜、操作繁瑣的缺點(diǎn)［4］。實(shí)驗(yàn)基于維生素C對羅丹明B和K2S2O8間經(jīng)Ag+催化的褪色反應(yīng)的抑制作用，研究響應(yīng)面分析法優(yōu)化抑制－褪色光度法測定維生素C的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土泡參 采自甘肅省隴西，將土泡參先經(jīng)自來水、蒸餾水清凈，烘干至恒重，粉碎過60目篩，備用; VC標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.20×10－2g/L;Ag(I)溶液 AgNO3(分析純)先配成1.000g/L貯備液，臨用時(shí)再稀釋至0.8006mg/L;過硫酸鉀溶液 1.00×10－3mol/L;羅丹明B(RB)溶液 1.00×10－5mol/L;HAc溶液1.00mol/L;試劑 為分析純;實(shí)驗(yàn)用水 均為蒸餾水;所用儀器 均經(jīng)自來水、蒸餾水清洗備用。

WFJ－2100型分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;Lambda系列紫外/可見分光光度計(jì) 美國PerkinElmer公司;GB204電子天平 梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;DK－98－Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋

天津市泰斯特儀器有限公司;YLD－2100電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取25mL容量瓶，加2.00mL RB，1.00mL HAc，4.00mL K2S2O8，2.00mL Ag(I)，混勻，再加0.10mL VC標(biāo)準(zhǔn)溶液，以水定容，于(50±0.2)℃恒溫水浴鍋中保持10min，取出流水冷卻至室溫，用1cm比色皿于556nm處，以水作參比，測量試劑空白的吸光度(A0)及試劑的吸光度(Ai)。ΔA=Ai－A［4］0。

1.2.1 測定波長的選擇 取25mL容量瓶，加2.00mL RB，1.00mL HAc，4.00mL K2S2O8，2.00mL1.000g/L Ag(I)，混勻，再加入0.10mL VC標(biāo)準(zhǔn)溶液，以水定容，于(50±0.2)℃恒溫水浴鍋中保持10min，取出流水冷卻至室溫，以不加標(biāo)準(zhǔn)溶液的相應(yīng)溶液為空白，在波長400～600nm進(jìn)行縮小范圍的連續(xù)波長掃描。結(jié)果表明在波長556nm處有最大吸收，因此選擇556nm為測定波長。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)方法，分別以RB的用量、HAc的用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間為影響因素，設(shè)置四個(gè)因素的不同水平，來確定相關(guān)因素對抑制－褪色光度法測定維生素C的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)［5－8］在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取RB的用量、HAc的用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，以溶液的吸光度為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，設(shè)計(jì)了四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其水平編碼表見表1。

表1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素水平編碼

1.2.4 VC含量的測定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取25mL容量瓶，加7.00mL RB，2.80mL HAc，4.00mL K2S2O8，2.00mL 0.8006mg/L Ag(I)，混勻，再分別加入 0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50mL VC標(biāo)準(zhǔn)溶液，以水定容，于(20±0.2)℃恒溫水浴鍋中保持11.80min，取出流水冷卻至室溫，以蒸餾水為試劑空白，在波長556nm處測定吸光度值，作VC含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 土泡參溶液的配制 根據(jù)本課題組之前所做工作，稱取1.0003g土泡參置于圓底燒瓶中，按1∶30料液比，加入30mL的蒸餾水，在35℃的水浴中回流三次，抽濾。最后將濾液用蒸餾水定容到100mL的容量瓶中，搖勻。

1.2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)方法，選擇響應(yīng)面設(shè)計(jì)的最佳反應(yīng)條件，加入各種試劑，然后再取土泡參溶液4.00mL，測量吸光度值，平行測5次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算精密度。

1.2.4.4 回收率實(shí)驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)方法，選擇響應(yīng)面設(shè)計(jì)的最佳反應(yīng)條件，加入各種試劑于5個(gè)25mL容量瓶中，然后分別加入土泡參溶液4.00mL，最后分別加入VC標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50mL，測量吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可得相應(yīng)的VC的含量，進(jìn)而求出對應(yīng)的理論的VC含量，計(jì)算VC回收率。

1.2.4.5 樣品分析 按照精密度實(shí)驗(yàn)的步驟，測量相應(yīng)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出土泡參中總的VC質(zhì)量，再由以下公式計(jì)算出VC在土泡參樣品中的百分含量∶

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1 吸收曲線和測定波長的確定

按照實(shí)驗(yàn)方法繪制吸收光譜。圖1表明∶各條曲線于556nm處均有最大吸收峰，因此選擇λ= 556nm作為VC的測量波長。

圖1 吸收光譜

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果［8］

2.2.1 羅丹明B的用量對抑制－褪色反應(yīng)的影響固定HAc的用量1.00mL，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間10min，考察RB的用量對吸光度的影響。由圖2可看出，在其它條件不變情況下，隨RB的用量增大，對應(yīng)的吸光度也隨之增大。當(dāng) RB的用量在1.00～5.50mL的范圍內(nèi)時(shí)，吸光度均小于0.20，當(dāng)RB的用量在6.00mL時(shí)，吸光度大于0.20，符合測定吸光度條件。綜合各種因素，選擇RB的用量為6.00mL。

圖2 羅丹明B的用量對抑制－褪色反應(yīng)的影響

2.2.2 HAc的用量對抑制－褪色反應(yīng)的影響 固定RB的用量6.00mL，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間10min，考察HAc的用量對吸光度的影響。圖3結(jié)果顯示，影響抑制－褪色反應(yīng)的最佳HAc的用量為3.00mL。

圖3 HAc的用量對抑制－褪色反應(yīng)的影響

2.2.3 反應(yīng)溫度對抑制－褪色反應(yīng)的影響 固定RB的用量 6.00mL，HAc的用量 3.00mL，反應(yīng)時(shí)間10min，考察反應(yīng)溫度對吸光度的影響。圖4結(jié)果顯示，影響抑制－褪色反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度為25℃。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對抑制－褪色反應(yīng)的影響 固定RB的用量6.00mL，HAc的用量3.00mL，反應(yīng)溫度為25℃，考察反應(yīng)時(shí)間對吸光度的影響。圖5結(jié)果顯示，影響抑制－褪色反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間為11min。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)與結(jié)果

按照Box－Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行了四因素三水平實(shí)驗(yàn)，以吸光度值為指標(biāo)，研究各因素間相互作用下的吸光度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。表2中1～24為析因?qū)嶒?yàn)，25～29為中心實(shí)驗(yàn)。29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用來估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差［5］。

表3 回歸方程方差分析

圖4 反應(yīng)溫度對抑制－褪色反應(yīng)的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對抑制－褪色反應(yīng)的影響

2.4 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

采用Design－expert 7.1.6軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型∶

因素的ANOVA分析結(jié)果見表3。

由表3可看出，模型的“Prob＞F”值小于0.0001，表明二次方程擬合極顯著，失擬項(xiàng)F值大于0.05，表明失擬項(xiàng)相對于絕對誤差是不顯著的。決定系數(shù)為R2=0.9889，也說明回歸方程的擬合程度很好，失擬較小。從表3中的P值可知，方程中X1、對Y值的影響極顯著(P＜0.01)，X1X3、X1X4、對Y值的影響顯著(P＜0.05)，表明方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響都是顯著的，交互項(xiàng)作用影響也是顯著的，這與模擬回歸預(yù)測吻合。各交互因素響應(yīng)面圖如圖6～圖9，

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 RB用量和HAc用量的交互作用

圖7 RB用量和反應(yīng)溫度的交互作用

圖8 RB用量和反應(yīng)時(shí)間的交互作用

圖9 HAc用量和反應(yīng)時(shí)間的交互作用

決定系數(shù)R2=0.9889說明模型擬合好，實(shí)驗(yàn)誤差小，實(shí)驗(yàn)操作可信，可用此模型優(yōu)化抑制－褪色光度法測定維生素C的條件。

通過回歸模型預(yù)測的抑制－褪色光度法測定維生素C的最佳條件為∶羅丹明B用量6.99mL，HAc用量2.81mL，反應(yīng)溫度20.0℃，反應(yīng)時(shí)間11.82min，在此條件下，吸光度值理論上可達(dá)0.285考慮到實(shí)際操作的可行性，將抑制－褪色光度法測定維生素C的條件在回歸方程得到的理論值基礎(chǔ)上修正為∶羅丹明B用量7.00mL，HAc用量2.80mL，反應(yīng)溫度20.00℃，反應(yīng)時(shí)間11.80min，在此條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測得的平均吸光度值為0.286，與實(shí)際值相差甚微，說明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)可靠，具有一定的實(shí)際價(jià)值。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程

按最佳實(shí)驗(yàn)條件，取不同體積VC標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系見圖10。

圖10 VC標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 土泡參中VC含量測定結(jié)果

取三個(gè)25mL的容量瓶，根據(jù)回歸模型預(yù)測的抑制－褪色光度法測定維生素C的最佳條件，分別加入各種試劑，然后分別準(zhǔn)確加入土泡參溶液4.00mL，測得值為0.286。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得，土泡參溶液中VC的含量為0.08mg/g。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 回收率測定結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化抑制－褪色光度法測定維生素C的實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果表明∶羅丹明B的用量、HAc用量二次方項(xiàng)、反應(yīng)時(shí)間二次方項(xiàng)對Y值的影響極顯著(P＜0.01)，羅丹明B的用量和反應(yīng)溫度、羅丹明B的用量和反應(yīng)時(shí)間的交互作用對Y值的影響顯著(P＜0.05)，說明羅丹明B的用量、HAc的用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間在抑制－褪色光度法測定維生素C的實(shí)驗(yàn)中不是簡單的線性關(guān)系。

3.2 回歸分析及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、可行。抑制－褪色光度法測定維生素C的最佳實(shí)驗(yàn)條件為∶羅丹明B用量6.99mL，HAc用量2.81mL，反應(yīng)溫度20.0℃，反應(yīng)時(shí)間11.82min。在此條件下，測得土泡參中VC的含量為0.08mg/g。該方法精密度好，RSD(n=5)為 0.25%，回收率高，平均回收率為100.97%。

［1］王榮耕.VC單磷酸酯鎂［J］.精細(xì)與專用化學(xué)品，2001 (3):14.

［2］樂微，楊靜.膠束增敏法測定果蔬中VC的含量［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2009，30(6):35－36.

［3］楊秀芳，程芳玲，梁棟.碘離子選擇電極測定果蔬、藥劑中V含量［J］.遼寧化工，2003，32(8):366－368.

［4］劉佳銘.抑制－褪色光度法測定維生素C［J］.分析化學(xué)研究簡報(bào)，2000，28(9):1147－1149.

［5］游慶紅，尹秀蓮.響應(yīng)面優(yōu)化桑黃多糖提取工藝研究［J］.中國釀造，2010(5):67－69.

［6］余安，王承明.響應(yīng)面優(yōu)化花生粕中植酸的提取工藝研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2010，25(4):80－84.

［7］胡成旭，侯欣彤，馮永寧，等.響應(yīng)面優(yōu)化云芝多糖提取條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2007(7):124－126.

［8］任雪峰，吳冬青，王永生，等.人參果多糖超聲提取工藝的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31(1):9－11.

［9］陳芹芹，李淑燕，楊陽，等.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取蘋果籽油的工藝研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2010，25(5):52－56.

［10］袁志發(fā)，周靜芋.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析［M］.北京:高等教育出版社，2000:381.

［11］周紀(jì)薌.實(shí)用回歸分析方法［M］.上海:上?？萍技夹g(shù)出版社，1990:77－79.

Study on optimization of conditions of determination of vitamin C by
inhibition discoloring spectrophotometry using response surface methodolgy

WANG Qiao－ying，WU Dong－qing，AN Hong－gang，SONG Hai，REN Xue－feng*
(Department of Chemistry，Hexi University，Zhangye 734000，China)

Base on the inhibition effect of Vitamin C on discoloring reaction between Rhodamin B and K2S2O8by Ag+catalysis，response surface methodology(RSM)was emplyed to optimize the condition(temperature，time，dosage of RB，dosage of HAc).The result of RSM showed that the optimum condition was as fllows:reaction temperature 20.0℃，reaction time 11.82min，dosage of RB 6.99mL and dosage of HAc 2.81mL.Under these condition，the content of Vitamin C from Tragopogon porrifolius L.is 0.08mg/g.The results showed that recovery of standard addition was 100.97%，and the RSD(n=5)was 0.25%.

RSM;discoloring reaction;Vitamin C;condition test

TS207.3

A

1002－0306(2011)11－0443－05

2010－10－21 *通訊聯(lián)系人

王巧英(1989－)，女，研究方向:天然產(chǎn)物提取與分離。

甘肅省教育廳(1009－09)科研資助項(xiàng)目。