韋漢昌，韋善清，何建華

(1.廣西師范大學，廣西桂林 541004; 2.南寧地區(qū)教育學院，廣西南寧 530001;3.廣西大學，廣西南寧 530001)

高壓脈沖電場協(xié)同酶法提取牛骨蛋白的研究

韋漢昌1，2，韋善清3，何建華2

(1.廣西師范大學，廣西桂林 541004; 2.南寧地區(qū)教育學院，廣西南寧 530001;3.廣西大學，廣西南寧 530001)

以新鮮牛骨為原料，研究高壓脈沖電場協(xié)同風味酶提取牛骨蛋白。實驗結(jié)果表明，牛骨粉經(jīng)高壓脈沖電場處理再進行酶解，不僅能夠提高骨蛋白溶出率，而且能縮短酶解時間。在電場強度30kV·cm－1、脈沖數(shù)25、料液比1∶8、酶用量4000U/g(骨粉質(zhì)量)、酶解溫度50℃、pH6.5等條件下，酶解30min，牛骨蛋白溶出率可達65.2%。

高壓脈沖電場，酶解，牛骨，蛋白質(zhì)，提取

牛骨中含有豐富的蛋白質(zhì)，新鮮牛骨中蛋白質(zhì)含量為11.5%，其中含有17種氨基酸，其中有8種人體所必需的氨基酸［1］。牛骨蛋白90%為膠原蛋白，其具有良好的物理性能和生物學特性，在化工、食品添加劑、美容化妝品、醫(yī)學、生物材料以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應用。目前提取動物蛋白的方法主要是酶解法，但該方法酶解時間長、提取率較低。高壓脈沖電場(PEF)提取技術(shù)源于非熱滅菌技術(shù)，是一種最有前途的、可實現(xiàn)工業(yè)化應用加工的技術(shù)。高壓脈沖電場可在瞬間使被處理細胞的細胞壁和細胞膜電位混亂，改變其通透性，并可擊破細胞壁和細胞膜，發(fā)生不可逆破壞，造成細胞新陳代謝紊亂、細胞中生長的必需組分流出，不僅能滅菌，而且有助于天然物質(zhì)的提?。?－3］。近幾年，高壓脈沖電場提取技術(shù)應用于植物成分的提取研究中取得了一些進展［4］，但應用于動物骨蛋白的提取研究甚少。本文研究了高壓脈沖電場協(xié)同酶解技術(shù)從牛骨中提取牛骨蛋白，為高壓脈沖電場提取動物蛋白的研究和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牛肋骨 市售;風味酶 南寧東恒華道生物科技有限責任公司，25萬U/g;碳酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸 西隴化工，AR。

IHV－30高壓電場脈沖發(fā)生器 成都英特羅克科技有限公司;靜態(tài)處理腔 電極間距可調(diào)，自制; PHS－3C pH計 上海雷磁;KDT－1000全自動定氮儀 蘇州天威儀器有限公司;RE201C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器愛博特科技發(fā)展有限公司;FW－100高速萬能粉碎機

天津泰斯特儀器有限公司;TD5A－WS離心機 湘儀離心機儀器有限公司;DZKW－4電子恒溫水浴鍋

南昌市恒順化驗設備制造有限公司;電動攪拌器。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛骨粉的制備 用切割機將新鮮牛肋骨切割成長度為3～5cm的骨塊，清水洗凈牛骨塊，剔除非骨成分。牛骨塊置于鍋中，以蒸餾水剛好浸沒為宜，微沸1h，除去殘血，取出脫脂;高壓蒸煮3～4h至牛骨軟化并與肉、脂分離，即可出鍋。用雙層紗布過濾，濾液冷卻至10℃除去脂肪后可用于制備骨汁粉。骨塊65℃恒溫干燥24h后進行粗粉碎、細粉碎，過160目篩。細粉碎時加入適量的環(huán)狀糊精以消除制品的腥臊氣味。

1.2.2 牛骨蛋白質(zhì)提取 選用風味酶為水解酶。該酶水解動物蛋白質(zhì)得到的水解液澄清、無苦味、鹽含量低，進行Maillard反應后所得的蛋白質(zhì)能保持原有風味，產(chǎn)品可用于制備風味食品添加劑。

考慮到高壓脈沖電場對酶活性的影響［5－7］，本實驗分兩步進行。第一步是將牛骨粉按一定的料液比與水混合，浸泡6h，然后放入耐高壓絕緣袋并置于處理腔進行高壓脈沖電場預處理;第二步是控制一定的酶用量、溫度、酸度、料液比及酶解時間進行酶解，酶解結(jié)束后高速離心分離殘渣，將水解液溫度升高到130～140℃，恒溫1h進行Maillard反應。

1.2.3 牛骨蛋白溶出率計算方法 參照國標GB/T 5009.5－2003，采用凱氏定氮法測定牛骨粉中蛋白質(zhì)的含量及提取液中蛋白質(zhì)濃度。牛骨蛋白溶出率的計算公式如下。

牛骨蛋白溶出率(%)=提取液中蛋白質(zhì)濃度(g/mL)×提取液體積(mL)/［骨粉質(zhì)量(g)×骨粉中蛋白質(zhì)含量］×100%

1.2.4 提取條件研究方法 根據(jù)廠家提供的技術(shù)數(shù)據(jù)，風味酶水解動物蛋白的適宜條件為溫度50℃、pH6.5、酶用量4000U/g(骨粉)、酶解時間5～7h。本研究在溫度、酸度及酶用量不變情況下考察脈沖電場強度、脈沖數(shù)、料液比及酶解時間等單因素對牛骨蛋白溶出率的影響，然后在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，按L9(34)正交表進行四因素三水平正交實驗，并用正交實驗助手V3.1軟件對實驗結(jié)果進行極差分析和方差分析，優(yōu)化提取條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛骨粉中蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

表1 牛骨粉中蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

2.2 高壓脈沖電場輔助風味酶提取牛骨蛋白單因素實驗

在溫度50℃、pH6.5、酶用量4000U/g(骨粉)等條件下，考察高壓脈沖電場強度、脈沖數(shù)、料液比及酶解時間等對牛骨蛋白溶出率的影響。

2.2.1 電場強度的影響 圖1為在脈沖數(shù)15、料液比1∶10及酶解時間30min等條件下脈沖電場強度對牛骨蛋白溶出率影響的實驗結(jié)果。實驗結(jié)果顯示，電場強度低于10kV·cm－1時，對骨蛋白溶出率影響不大;電場強度超過15kV·cm－1時，蛋白質(zhì)溶出率顯著增大，此時細胞膜、細胞壁被擊穿的孔數(shù)大幅增加，細胞內(nèi)物質(zhì)流出增加;超過30kV·cm－1后，溶出率增幅趨緩，此時的膜孔已經(jīng)完全被不可逆擊穿。盡管脈沖電場強度超過30kV·cm－1后，蛋白質(zhì)溶出率仍有所增加，但是考慮到電場強度過大，容易使蛋白質(zhì)發(fā)生變性［8－12］，脈沖電場強度不宜太高，應控制在30kV·cm－1以下。

圖1 電場強度對骨蛋白溶出率的影響

2.2.2 脈沖數(shù)的影響 圖2為脈沖電場強度25kV· cm－1、料液比1∶10及酶解時間30min等條件下，脈沖數(shù)對骨蛋白溶出率的影響。圖2中顯示脈沖數(shù)超過20次后，溶出率增幅變小。

圖2 脈沖數(shù)對骨蛋白溶出率的影響

2.2.3 料液比的影響 料液比是影響蛋白質(zhì)溶出率的主要因素之一，料液比增大有利于高壓脈沖電場抽提骨蛋白，但料液比增大會使酶的濃度降低，不利于蛋白質(zhì)降解。圖3為在脈沖電場強度25kV·cm－1、脈沖數(shù)

15及酶解時間30min等條件下，料液比對骨蛋白溶出率的影響。實驗結(jié)果顯示，料液比適當增大時，有利于蛋白質(zhì)溶出，料液比超過1∶8時，骨蛋白溶出率下降，因此料液比應控制在1∶8較為適宜。

圖3 料液比對提取率的影響

2.2.4 酶解時間的影響 圖4為在脈沖電場強度25kV·cm－1、脈沖數(shù)15、料液比1∶10等條件下，酶解時間對骨蛋白溶出率影響的實驗結(jié)果。由圖4可知，骨蛋白溶出率隨酶解時間增加而增大，但超過30min后，骨蛋白溶出率增幅變小。

圖4 酶解時間對骨蛋白溶出率的影響

2.3 高壓脈沖電場輔助風味酶提取牛骨蛋白提取條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，在50℃、pH=6.5及酶用量4000U/g(骨粉)等條件下，以電場強度、脈沖數(shù)、料液比及酶解時間作為考察因素，各取三個水平，以骨蛋白溶出率為考察指標，按L9(34)正交表進行實驗設計，優(yōu)化提取條件。水平取值、實驗結(jié)果、極差分析結(jié)果及方差分析結(jié)果分別見表2、表3。

表2 正交實驗結(jié)果及極差分析

表3 方差分析結(jié)果

極差分析結(jié)果與方差分析結(jié)果無明顯差異，四因素影響顯著性為A＞B＞C＞D，最佳提取工藝條件為A3B3C2D2，即電場強度30kV·cm－1，脈沖數(shù)25、料液比1∶8及酶解時間30min。此條件進行三次平行實驗，牛骨蛋白溶出率的平均值為65.2%。

3 結(jié)論

表4為在酶解溫度50℃、pH6.5、酶用量4000U/g (骨粉)、料液比1∶8等條件下，風味酶獨立水解法與高壓脈沖電場輔助風味酶水解法平行實驗結(jié)果的比較。

表4 水解效果比較

從實驗結(jié)果看，高壓脈沖電場輔助法不僅能有效提高骨蛋白溶出率，而且也能大幅縮短酶解時間，酶解效率更高。

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Research on extracting protein from cattle bone by enzymolysis coupled with PEF

WEI Han－chang1，2，WEI Shan－qing3，HE Jian－h(huán)ua2
(1.Guangxi Normal University，Guilin 541004，China; 2.Nanning Prefecture Education College，Nanning 530001，China; 3.Guangxi University，Nanning 530001，China)

The technology of extracting protein from cattle bone by flavor protease coupled with pulsed electric field (PEF)was researched.For extracting protein from cattle bone powder pre－treated by PEF，the results of experiments showed that it not only could make the enzymolysis time short but also increase the dissolution ratio of protein.Under the conditions of electric field intensity 30 kV·cm－1，pulse number 25 times，material to liquid ratio 1∶8(g/mL)，enzymes usage 4000U/g，enzymolysis temperature 50℃，pH=6.5 and enzymolysis time 30min，the dissolution ratio of bone protein could reach 65.2%.

PEF;enzymolysis;cattle bone;protein;extraction

TS251.94

A

1002－0306(2011)11－0280－03

2011－06－27

韋漢昌(1963－)，男，副教授，研究方向:天然物質(zhì)的提取。

廣西自然科學基金資助項目(桂科自0832105)。