李小永，陳 偉，程 芳，李 靖

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018)

一株細(xì)菌型豆豉發(fā)酵菌種的篩選及鑒定

李小永，陳 偉*，程 芳，李 靖

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018)

從臨沂細(xì)菌型豆豉中篩選出一株適于豆豉生產(chǎn)的高產(chǎn)蛋白酶菌種，并對(duì)此菌種進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:采用酪蛋白平板初篩，制曲復(fù)篩，根據(jù)曲樣蛋白酶酶活以及游離態(tài)含量共選出5株優(yōu)良菌株用于豆豉的制作，由成品豆豉的理化指標(biāo)和感官評(píng)定認(rèn)為D2號(hào)菌種發(fā)酵的豆豉風(fēng)味好，滋味鮮美。結(jié)合生理生化和16S rDNA序列分析初步鑒定D2號(hào)菌種為枯草芽孢桿菌，該菌株來(lái)源于豆豉，屬于安全菌種，具有研究開(kāi)發(fā)價(jià)值。

細(xì)菌型豆豉，分離，鑒定，16S rDNA

豆豉起源于我國(guó)，它是以黃豆和黑豆為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而制成的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，按制曲發(fā)酵時(shí)參與的主要微生物種類的不同，豆豉分為米曲霉型、根霉型、毛霉型、細(xì)菌型以及脈胞菌型五大類產(chǎn)品［1］，其中山東臨沂的八寶豆豉就是細(xì)菌型豆豉的典型代表，此外在云南、四川、貴州等省民間也有細(xì)菌型豆豉的制作。國(guó)外細(xì)菌型豆豉以日本的納豆最為出名，嚴(yán)格來(lái)說(shuō)納豆源于我國(guó)細(xì)菌型豆豉，是我國(guó)細(xì)菌型豆豉的孿生姐妹。用蛋白酶產(chǎn)生菌進(jìn)行豆豉的制作，微生物產(chǎn)生的胞外蛋白酶可直接作用于大豆蛋白，將大分子蛋白質(zhì)水解成小分子肽類以及游離態(tài)氨基酸，這些物質(zhì)不僅易為人體消化吸收，還具有很強(qiáng)的生物活性，并且對(duì)豆豉的風(fēng)味也有很大的影響，這對(duì)功能性豆豉食品的研制十分有利，目前日本流行的功能性食品納豆就是利用納豆芽孢桿菌(Bacillus stubtilis natto)為主要發(fā)酵劑生產(chǎn)的，因該菌能產(chǎn)納豆激酶(Nattokinase，NK)，一種絲氨酸蛋白酶［2］，并且有很強(qiáng)的溶栓活性，受到了廣泛的關(guān)注，而我國(guó)細(xì)菌型豆豉還沒(méi)有明確的發(fā)酵菌種，這導(dǎo)致了我國(guó)細(xì)菌型豆豉的生產(chǎn)規(guī)模以及制作工藝都受到很大程度的限制。目前我國(guó)豆豉的生產(chǎn)仍是以傳統(tǒng)的自然發(fā)酵為主，由于菌種沒(méi)有明確的分離鑒定，尚未制作成發(fā)酵劑，另外在民間制作發(fā)酵過(guò)程中各項(xiàng)條件難以控制，存在著安全隱患［3］。結(jié)合以上問(wèn)題，以臨沂八寶豆豉為原料，通過(guò)酪蛋白初篩，制曲復(fù)篩篩選出高產(chǎn)蛋白酶菌種，并進(jìn)一步制作豆豉，篩選出適于豆豉生產(chǎn)的高產(chǎn)蛋白酶菌種，并對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定，同時(shí)結(jié)合16S rDNA對(duì)該優(yōu)良菌種進(jìn)行鑒定，旨在篩選出適合豆豉生產(chǎn)的優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

沂蒙特產(chǎn)八寶豆豉 臨沂惟一齋醬園生產(chǎn)，購(gòu)于泰安銀座超市;黑豆 購(gòu)買(mǎi)于泰安中百商城;干酪素、酪氨酸，DNA marker，瓊脂糖以及其它電泳試劑

均為生化試劑;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天跟公司;活化、保存菌種培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基;初篩培養(yǎng)基 酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基［4］;產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基［5］肉湯培養(yǎng)基100mL，玉米粉5g，酵母膏0.5～1g，pH 7.2～7.4。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌型豆豉中產(chǎn)蛋白酶菌種的初篩 無(wú)菌操作取25g豆豉加入到含有225mL無(wú)菌生理鹽水的搖瓶中，在搖床上200r/min分散10min，得到稀釋10倍的菌液，再依次用生理鹽水稀釋得到稀釋倍數(shù)為105～107的菌液。分別取稀釋倍數(shù)為105～107的菌液100μL均勻涂布于酪蛋白培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做三個(gè)重復(fù)。37℃培養(yǎng)48h后觀察有透明圈菌落的形態(tài)、挑取有透明圈的菌落并將其反復(fù)劃線于酪蛋白瓊脂平板培養(yǎng)基上，直至分離成單菌落后將菌種接種在牛肉膏蛋白胨固體斜面培養(yǎng)基上于4℃下保存。然后用梯度稀釋法將菌液涂布在酪蛋白培養(yǎng)基上面，37℃培養(yǎng)48h后測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑的比值。

1.2.2 菌種活化 挑取一環(huán)斜面上面的菌種接種在活化液體培養(yǎng)基里，37℃搖瓶培養(yǎng)24h后保存在4℃。采用稀釋平板法計(jì)數(shù)。

1.2.3 細(xì)菌型豆豉中產(chǎn)蛋白酶菌種的復(fù)篩 將從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的黑豆用三倍體積的水浸泡24h，將黑豆取出瀝干，將黑豆放于燒杯中，燒杯上包八層紗布，并用報(bào)紙包好，121℃滅菌25min，滅菌后，待黑豆溫度降至40℃左右后按每100g接種2mL 108cfu/mL的菌液量將菌液在無(wú)菌條件下接種于黑豆中，混勻。37℃培養(yǎng)，每24h測(cè)一次蛋白酶活性，連續(xù)測(cè)定96h，從中篩選出蛋白酶活性較高的菌株。

1.2.4 蛋白酶酶活的測(cè)定 粗酶液的制備∶取10g曲樣室溫下研磨，然后加入60mL磷酸緩沖液(pH7.5)洗滌，將洗滌液裝入 150mL三角瓶中，30℃，160r/min條件下?lián)u床振蕩30min，然后用四層紗布過(guò)濾，濾液經(jīng)抽濾后取5mL于50mL容量瓶中，用磷酸緩沖液定容搖勻，即為粗酶液。蛋白酶酶活的測(cè)定∶采用紫外分光光度法［6］。

1.2.5 氨基態(tài)氮的測(cè)定 采用甲醛滴定法測(cè)定［7］。

1.2.6 豆豉制作工藝［8］黑豆→清洗→浸泡→高壓蒸煮→冷卻→接種→制曲→洗曲→拌鹽后酵→干燥→豆豉

前處理以及制曲同1.2.1，制曲72h后洗曲加鹽10%于45℃后酵15d，50℃條件下干燥。

1.2.7 豆豉主要成分分析 水分、粗蛋白質(zhì)、游離氨基態(tài)氮、總酸、脂肪以及灰分的測(cè)定參見(jiàn)文獻(xiàn)［9］?？偟脛P氏定氮法測(cè)定。

1.2.8 豆豉感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)［10］根據(jù)豆豉的色、香、味、體設(shè)計(jì)相關(guān)的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)制作后的豆豉由10名食品學(xué)院研究生進(jìn)行感官評(píng)定及打分，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 豆豉感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.9 菌種鑒定 菌體形態(tài)學(xué)和生理生化實(shí)驗(yàn)∶菌體形態(tài)特征和生理生化特征參照文獻(xiàn)［11－13］中的方法。分子生物學(xué)(16S rDNA)鑒定∶細(xì)菌總DNA提取以及方法參考細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒上面的說(shuō)明進(jìn)行。

16S rDNA的通用引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成∶

上游引物 P1∶5'－AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT－3';

下游引物P2∶5'－TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC－3'。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為∶95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min 30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10min，反應(yīng)后取5μL產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送華大測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果在GenBank中注冊(cè)并通過(guò)Blast進(jìn)行同源序列檢索，并用 MEGA5.0軟件采用鄰接法(Neighbor－Joining method)進(jìn)行聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。重復(fù)取樣1000次進(jìn)行自展值(bootstrap value)分析，以評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌型豆豉高產(chǎn)蛋白菌種的篩選

2.1.1 初篩結(jié)果 將梯度稀釋后的純菌種接種在酪蛋白培養(yǎng)基上面，37℃培養(yǎng)24h以觀察其透明圈大小，結(jié)果表明在接種的45株菌種中，共有30株形成可見(jiàn)的透明圈，根據(jù)透明圈直徑和菌落直徑比值的大小，共有10株透明圈直徑與菌落直徑比值大于3的菌種(表2)，選取該10株菌株進(jìn)行復(fù)篩。

表2 高產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩

2.1.2 復(fù)篩結(jié)果 對(duì)選取的10株菌種進(jìn)行豆豉制曲復(fù)篩，每隔24h測(cè)定一次酶活以及游離態(tài)氮，連續(xù)測(cè)定4d，由圖1可以看出，在72h內(nèi)各個(gè)菌種制曲產(chǎn)生的蛋白酶酶活隨制曲時(shí)間的延長(zhǎng)除D1和D13號(hào)菌種外均顯著上升，其中72h的酶活除D1和D13號(hào)菌種外均處于最高水平，而96h時(shí)各個(gè)曲樣的蛋白酶酶活均顯著下降，該時(shí)期的曲樣略有氨味，說(shuō)明該時(shí)期早已完成前發(fā)酵階段，若以該時(shí)期的曲樣進(jìn)行豆豉制作，所得的產(chǎn)品味道發(fā)苦，醬香不足，氨味較濃。制曲期間菌種利用黑豆中的各種可溶性蛋白質(zhì)及糖分進(jìn)行繁殖，并產(chǎn)生蛋白酶及其它酶類，同時(shí)完成前發(fā)酵過(guò)程。各曲樣的游離態(tài)氮含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)均有增加的趨勢(shì)，并且都高于原料黑豆中游離態(tài)氮的含量0.24g/100g，說(shuō)明菌種產(chǎn)生的胞外蛋白酶作用于黑豆的蛋白質(zhì)并產(chǎn)生多肽或氨基酸，這些物質(zhì)對(duì)豆豉的品質(zhì)、風(fēng)味以及營(yíng)養(yǎng)影響較大，根據(jù)曲樣的蛋白酶酶活以及曲樣中游離態(tài)氮含量，分別選取在72h時(shí)酶活大于150U/g和游離態(tài)氮含量大于0.3g/100g的菌種，即選取D2、D8、D10、D16、D17號(hào)菌種進(jìn)行豆豉制作。

表3 原料黑豆、純種發(fā)酵豆豉成品和市購(gòu)八寶豆豉主要成分的比較

表4 豆豉感官評(píng)定打分

圖1 各曲樣不同時(shí)間內(nèi)蛋白酶活力以及游離態(tài)氮含量變化

2.2 豆豉制作

2.2.1 豆豉各項(xiàng)成分測(cè)定 為了篩選出適于豆豉生產(chǎn)的菌種，分別對(duì)復(fù)篩中的5株菌種接種黑豆制作豆豉，因5個(gè)菌種在產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行芽孢染色均有芽孢產(chǎn)生，故這些菌種均為芽孢桿菌，故選取后酵溫度為45℃。表3給出了原料黑豆、純種發(fā)酵大豆以及市售八寶豆豉的各主要成分，從表中可以看出各個(gè)菌種發(fā)酵后的豆豉蛋白質(zhì)含量均有下降，但是氨基態(tài)氮、總酸以及灰分均比原料有很大的提高，這與李華等［7］研究的相符。與市購(gòu)八寶豆豉相比，由于原料以及發(fā)酵條件不同，蛋白質(zhì)含量較市購(gòu)八寶豆豉高，游離態(tài)氮以及其它指標(biāo)均接近于市購(gòu)八寶豆豉，并且各菌種發(fā)酵的豆豉均符合豆豉行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB82－1980中的規(guī)定。

2.2.2 感官評(píng)定結(jié)果 對(duì)制作的細(xì)菌型豆豉進(jìn)行感官評(píng)定(表4)，根據(jù)評(píng)定結(jié)果，D2號(hào)菌制作出來(lái)的豆豉具有細(xì)菌型豆豉特有的醬香，濃郁綿長(zhǎng)，并且滋味鮮美、軟硬適中，為最優(yōu)產(chǎn)品，對(duì)D2菌種進(jìn)行鑒定。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 D2菌體菌落描述 D2菌種在顯微鏡下觀察呈桿狀(圖2)，芽孢中生或端生，圓形或橢圓形，革蘭氏染色為陽(yáng)性。在固體培養(yǎng)基24h培養(yǎng)后菌落直徑2.1mm左右(圖2)，圓形，乳白色，表面褶皺，無(wú)光澤，邊緣不整齊。試管液體中培養(yǎng)有菌膜，菌膜表面褶皺，無(wú)沉淀。

圖2 D2菌種在顯微鏡以及LB培養(yǎng)基中形態(tài)特征

2.3.2 生理生化特征 以枯草芽孢桿菌為參照菌種，對(duì)D2號(hào)菌種進(jìn)行部分生理生化特征的測(cè)定以及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，生理生化包括過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、對(duì)氧需求、V－P測(cè)定、明膠液化、淀粉水解、吲哚實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn);糖醇發(fā)酵包括葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇;并分別觀察在2%、5%、7%、10%NaCl含量條件下菌種的生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明D2號(hào)菌種與參照菌種的生理生化特征相似。參考文獻(xiàn)［3－5］中對(duì)枯草芽孢桿菌的描述以及生理生化特征，確定D2菌種為枯草芽孢桿菌。

2.3.3 菌株16S rDNA序列擴(kuò)增 以菌株D2的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增后經(jīng)電泳檢測(cè)得到一條大約1500bp的特異性條帶，與預(yù)期的基因片段大小一致，如圖3所示。

2.3.4 16S rDNA序列測(cè)定及分析 菌株 D2 16S rDNA序列擴(kuò)增經(jīng)測(cè)定，全長(zhǎng)為 1436bp(登錄號(hào)∶

圖3 菌株16SrDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

HQ221994)。將該序列通過(guò)BLAST進(jìn)行同源序列檢索發(fā)現(xiàn)，在親緣關(guān)系相近的前100個(gè)序列中，99個(gè)為芽孢桿菌屬的菌株，其中同源性最高的前10個(gè)菌株中有7個(gè)為枯草芽孢桿菌，D2菌株與它們都具有99%以上的相似性。其中與Bacillus subtilis(登錄號(hào)∶GQ861470.1)的差異性最小，同源性水平最高。

根據(jù)16S rRNA序列同源性比對(duì)結(jié)果，選取來(lái)自核酸數(shù)據(jù)庫(kù)上有代表性的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、蘇云金芽孢桿菌 (B.thuringiensis)、巨大芽孢桿菌 (B.megaterium)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmu)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) 和 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌 (Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)等9株芽孢桿菌的16S rDNA的序列與 D2菌種的16S rDNA序列以多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa，EU855214)作為一個(gè)單獨(dú)的外群種用鄰接法(Neighbor－Joining method)進(jìn)行聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果見(jiàn)圖4，分支上的數(shù)據(jù)為1000次重復(fù)獲得的自展檢驗(yàn)Boot strap值，由系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可知，D2菌種與枯草芽孢桿菌 B.subtilis(登錄號(hào)∶EU855214)落在同一分支，并且具有較高的自展值(boot strap value，100%)，與其它細(xì)菌均相距較遠(yuǎn)，表明D2菌種與B.subtilis的親緣關(guān)系最近，結(jié)合該菌形態(tài)及生理生化特征初步判斷該菌株屬于枯草芽孢桿菌。

圖4 D2菌種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀關(guān)系圖(括號(hào)內(nèi)為菌種的登錄號(hào))

3 討論

豆豉的生產(chǎn)分為前酵(制曲)和后酵兩個(gè)階段，制曲階段主要是利用菌種產(chǎn)酶，后酵則主要是利用微生物和酶的作用提高產(chǎn)品風(fēng)味和增強(qiáng)保藏性［14］。豆豉中微生物產(chǎn)生的蛋白酶使蛋白質(zhì)分解成胨、多肽、氨基酸等，這些物質(zhì)不僅可以賦予產(chǎn)品鮮味，而且還利于消化吸收、具有多種生理功能［3］，故以高產(chǎn)蛋白酶菌種接種黑豆進(jìn)行豆豉制作，制作出的產(chǎn)品不但符合豆豉產(chǎn)品的最終要求，而且還具有多種功能性成分。

本研究通過(guò)對(duì)高產(chǎn)蛋白酶菌種的篩選，經(jīng)豆豉制作，綜合豆豉理化指標(biāo)以及感官評(píng)定篩選出一株優(yōu)良菌種，并通對(duì)該菌種的生理生化以及分子檢測(cè)，初步認(rèn)為該菌種為枯草芽孢桿菌。而枯草芽孢桿菌作為一種安全多功能、無(wú)毒、無(wú)害的菌種［15］，已被廣泛應(yīng)用于食品以及醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)。

枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生大量的淀粉酶和蛋白酶，是細(xì)菌型豆豉發(fā)酵過(guò)程中不可缺少的菌種［3］，目前用于豆豉發(fā)酵最多的是納豆的生產(chǎn)，是利用枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)作為發(fā)酵菌種的日本細(xì)菌型豆豉。而我國(guó)細(xì)菌型豆豉的制作由于沒(méi)有明確菌體的菌種，生產(chǎn)過(guò)程及發(fā)酵均難以控制，并且還存在一定的安全隱患，故明確豆豉發(fā)酵菌種，并利用豆豉中優(yōu)良菌種進(jìn)行豆豉制作具有重要意義。

豆豉制曲期間游離態(tài)氮以及蛋白酶酶活隨著制曲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)?shù)鞍酌该富钸_(dá)到一定值時(shí)，曲樣的蛋白酶酶活開(kāi)始下降。與其它芽孢桿菌相比，枯草芽孢桿菌更適合作為豆豉的發(fā)酵菌種。從豆豉中篩選高產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌種，并純種制作出的豆豉，符合豆豉行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

4 結(jié)論

采用酪蛋白平板初篩，制曲復(fù)篩，選取D2、D8、D10、D16、D17號(hào)菌種進(jìn)行豆豉制作，經(jīng)測(cè)定5種成品豆豉的理化指標(biāo)均符合豆豉行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，綜合豆豉理化指標(biāo)和感官評(píng)定認(rèn)為D2號(hào)菌種蛋白酶產(chǎn)量高，發(fā)酵風(fēng)味好。生理生化和16S rDNA序列分析結(jié)果鑒定該菌為枯草芽孢桿菌。菌株 D2 16S rDNA序列經(jīng)測(cè)定，全長(zhǎng)為 1436bp(登錄號(hào)∶HQ221994)，與Bacillus subtilis的差異性最小，同源性水平最高。該菌種源于豆豉，屬于安全菌種，具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

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Screening and identification of a strain for lobster sauce fermentation

LI Xiao－yong，CHEN Wei*，CHENG Fang，LI Jing
(College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China)

A bacteria producing high protease and suiting for fermenting lobster sauce from bacteria lobster sauce of Lin Yi was screened and identified.The result showed that five high－yield strains of protease were screened by casein plate and re－screened by starter making.According to the enzyme activity and free nitrogen’s content of startor of lobster sauce，five superior strains were used to ferment lobster sauce respectively.According to the sensory tests，physical and chemical indexes of five products，the Lobster Sauce fermented by D2 strain had a good flavor and the product was very delicious.Combining physiological characters and the sequence analysis of 16S ribosomal DNA，the strain D2 was preliminarily identified as Bacillus subtilis.The strain from lobster sauce was safe，therefore it was worth further studying and developing.

bacteria lobster sauce;isolation;identification;16S ribosomal DNA

TS201.3

A

1002－0306(2011)11－0212－05

2010－10－28 *通訊聯(lián)系人

李小永(1985－)，男，碩士研究生，研究方向:工業(yè)微生物發(fā)酵。