李成葉，王德海*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，動(dòng)物疫病的發(fā)生與流行越來(lái)越復(fù)雜，并具有混合感染和繼發(fā)感染的新特點(diǎn)，在疾病的治療方面，抗生素以其方便、高效的優(yōu)勢(shì)在臨床應(yīng)用中占據(jù)主導(dǎo)地位，但由于抗生素類藥物的廣泛使用，使得病原菌的抗藥性日趨增強(qiáng)，而由于抗生素濫用而導(dǎo)致的抗生素殘留問(wèn)題也引用了全社會(huì)的關(guān)注[1]。本試驗(yàn)采用的5種細(xì)菌中，金黃色葡萄球菌是對(duì)人類危險(xiǎn)性最大的化膿性球菌[2],在醫(yī)院檢測(cè)的所有樣本中檢出率達(dá)到55.1%，是醫(yī)院內(nèi)交叉感染的重要傳染源[3],近年來(lái)由于廣泛應(yīng)用抗生素，耐藥菌株迅速增多，對(duì)青霉素-G、紅霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明、苯唑西林等常用抗菌藥物耐藥率均達(dá)60%以上[4]；鏈球菌血清型較多，也已出現(xiàn)了較多種的耐藥菌株；而大腸桿菌又屬于多血清型和變異性強(qiáng)的細(xì)菌，極易產(chǎn)生抗藥性[5]。因此，既能有效控制疾病的發(fā)生，又能降低細(xì)菌的耐藥性，進(jìn)而降低抗生素的濫用就成為當(dāng)前藥物研究的一個(gè)方向。

中草藥作為一種無(wú)污染、綠色、天然的藥物，具有多能性、性質(zhì)穩(wěn)定、資源廣泛、價(jià)格低廉的特點(diǎn)，且不易產(chǎn)生耐藥性，毒副作用小，已經(jīng)證實(shí)多種中草藥有抑菌或抗菌作用[6],其作為替代抗生素解決抗藥性和藥物殘留等方面的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越受到重視。利用中草藥防治動(dòng)物疾病，既是飼養(yǎng)動(dòng)物的需要，也是人們生活保健的需求。

本實(shí)驗(yàn)以梔子、艾葉、百部、黃連、貫眾、魚(yú)腥草、夏枯草、蒲公英、大青葉、黃柏、黃芩、紫草、金銀花、敗醬草、連翹15味中草藥對(duì)臨床分離的5株細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、白葡萄球菌、鏈球菌、雞大腸桿菌、仔豬大腸桿菌）的體外抑菌效果進(jìn)行觀察，從而為臨床應(yīng)用和科學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

金黃色葡萄球菌菌株分離自患葡萄球菌性關(guān)節(jié)炎雞的關(guān)節(jié)部位；白葡萄球菌分離自患葡萄球菌病鴨的肝臟部位；雞大腸桿菌分離自患大腸桿菌病雞的肝臟部位；鏈球菌分離自患鏈球菌性關(guān)節(jié)炎豬的關(guān)節(jié)部位；仔豬大腸桿菌分離自患大腸桿菌病仔豬的十二指腸部位。

以上菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院病理教研室分離、鑒定、保存，臨用前分別供試菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上培養(yǎng)18h，用生理鹽水將菌苔洗下，稀釋至濃度為1.2×1010CFU/ml的菌懸液，備用。

1.2 試劑及藥品

1.2.1 供試中草藥

梔子、艾葉、百部、黃連、貫眾、魚(yú)腥草、夏枯草、蒲公英、大青葉、黃柏、黃芩、紫草、金銀花、敗醬草、連翹均購(gòu)于武漢市天然藥物醫(yī)療研究院。

臨用前將各種中草藥分別稱取10g，放入三角燒瓶中，加入100ml以上自來(lái)水使淹沒(méi)過(guò)藥面5cm左右，浸泡30min后加熱煮沸30min，濾紙過(guò)濾取藥液，藥渣按以上方法再次操作，合并兩次藥液，加熱煮沸濃縮至10ml。即得每毫升含1g生藥的藥液。經(jīng)115℃高壓滅菌30分鐘并補(bǔ)充水分后備用.

（1984年1月6日講座，全文略有刪節(jié)。吳培華教授提供講座錄音，史悠整理，劉祥安教授審閱，在此特申謝忱?。?/p>

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

將15ml、pH7.4的滅菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基傾注于培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h，觀察無(wú)菌生長(zhǎng)后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）的要求進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。吸取20μl制備的菌懸液加入制備的基礎(chǔ)培養(yǎng)基表面，均勻涂布，于室溫下干燥3～5min后，用外徑6mm的硬塑料管將涂布有菌懸液的基礎(chǔ)培養(yǎng)平板等間隔對(duì)稱地打4個(gè)孔，挑出孔中培養(yǎng)基，并在酒精燈火焰上對(duì)培養(yǎng)平板封底，將各種供試中草藥用蒸餾水稀釋成 1.00g/ml、0.75g/ml、0.50g/ml、0.25g/ml、0.10g/ml、0.05g/ml等 6 個(gè)濃度，吸取藥液50μl加入孔中，每種中草藥每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)，然后將培養(yǎng)平板放入37℃溫箱培養(yǎng)18h用游標(biāo)卡測(cè)量抑菌圈直徑，同種中草藥同一濃度取其抑菌圈直徑的平均值，此即各種中草藥在不同濃度下對(duì)供試菌株的抑菌效果。

1.4 抑菌效果判斷標(biāo)準(zhǔn)

參考NCCLS推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，以抑菌圈直徑＞20mm為極敏，抑菌圈直徑在15～20mm之間為高敏，抑菌圈直徑在10～15mm之間為中敏，抑菌圈直徑＜10mm為低敏，無(wú)抑菌圈為耐藥。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試中草藥對(duì)臨床分離金葡菌的抑菌效果

表1 15種中草藥在不同濃度下對(duì)雞關(guān)節(jié)源性金葡菌的體外抑菌效果（n=4,單位mm）

表2 15種中草藥在不同濃度下對(duì)鴨肝臟源性白葡菌的體外抑菌效果（n=4,單位mm）

表3 15種中草藥在不同濃度下對(duì)豬關(guān)節(jié)源性鏈球菌體外抑菌效果（n=4，單位mm）

表4 15種中草藥不同濃度下對(duì)雞肝臟源性大腸桿菌的體外抑菌效果（n=4,單位mm）

由表2可知，對(duì)供試菌株白葡萄球菌來(lái)說(shuō)，在1.00g/ml濃度時(shí)除梔子外其它中草藥都表現(xiàn)為極敏。其中對(duì)0.10g/ml濃度以上的黃芩和金銀花，0.50g/ml濃度以上的艾葉、百部、貫眾、大青葉、紫草和敗醬草，0.75g/ml濃度的黃連、夏枯草和連翹也表現(xiàn)為極敏。而對(duì)0.05g/ml濃度以上的貫眾、大青葉、紫草、黃芩和金銀花，0.10g/ml濃度以上的百部、魚(yú)腥草、夏枯草和敗醬草，0.25g/ml濃度以上的艾葉、黃連和連翹，蒲公英和黃柏分別在0.5g/ml、0.75g/ml濃度以上時(shí)都表現(xiàn)為高敏。對(duì)1.00g/ml的梔子表現(xiàn)為中敏，同樣表現(xiàn)為中敏的還有0.05g/ml時(shí)的百部、魚(yú)腥草、夏枯草、敗醬草和連翹，0.10g/ml濃度時(shí)的黃連、蒲公英和連翹，0.25g/ml濃度的蒲公英和黃柏以及0.50g/ml濃度的黃柏。供試菌株對(duì)0.75g/ml和0.5g/ml濃度的梔子，0.1g/ml濃度的艾葉，0.05g/ml濃度的黃連和蒲公英均表現(xiàn)為低敏。而白葡萄球菌對(duì)0.25g/ml濃度以下的梔子，0.01g/ml濃度的黃柏，以及0.05g/ml濃度的艾葉均表現(xiàn)為耐藥。

由表3可知：供試菌株對(duì)1.00g/ml濃度的魚(yú)腥草、大青草、黃柏、紫草和連翹，以及0.50g/ml濃度以上的百部和金銀花均表現(xiàn)為極敏。而對(duì)1.00g/ml濃度的艾葉、貫眾、蒲公英、黃芩和敗醬草，0.75g/ml濃度的黃柏，0.50g/ml濃度以上的大青葉，0.25g/ml濃度以上的百部、紫草和連翹，以及0.10g/ml濃度以上的魚(yú)腥草和金銀花均表現(xiàn)為高敏。供試菌株表現(xiàn)為中敏的藥物有0.75g/ml濃度以上的梔子和艾葉，0.50g/ml濃度以上的黃連、蒲公英和敗醬草，0.25g/ml濃度的大青葉和黃柏，0.05g/ml濃度以上的貫眾、魚(yú)腥草、紫草、金銀花和連翹。而對(duì)0.50g/ml濃度的梔子和艾葉，0.25g/ml濃度以上蒲公英和敗醬草，0.10g/ml濃度的百部和大青葉，0.05g/ml濃度的大青葉均表現(xiàn)為低敏。而鏈球菌表現(xiàn)為耐藥的中草藥有夏枯草，0.75g/ml濃度以下的黃芩，0.25g/ml濃度以下的梔子、艾葉和黃連，0.10g/ml濃度以下的蒲公英、黃柏和敗醬草。

由表4可知：供試菌株只對(duì)1.00g/ml濃度時(shí)的敗醬草和連翹，0.75g/ml濃度以上的大青葉和黃芩表現(xiàn)為極敏。而對(duì)1.00g/ml濃度時(shí)的梔子、艾葉、百部、蒲公英和黃柏，0.50g/ml濃度以上的大青葉和紫草，0.25g/ml濃度以上的連翹，0.10g/ml濃度時(shí)的黃芩表現(xiàn)為高敏。而對(duì)1.00g/ml濃度時(shí)夏枯草，0.75g/ml濃度以上的梔子、百部和黃連，0.5g/ml濃度的艾葉，0.25g/ml濃度的大青葉，0.1g/ml濃度以上的蒲公英、紫草和敗醬草，以及0.05g/ml濃度以上的黃芩和連翹，均表現(xiàn)為中敏。而對(duì)0.25g/ml濃度時(shí)艾葉，0.10g/ml濃度的大青葉和0.05g/ml濃度的蒲公英、紫草和敗醬草均表現(xiàn)為低敏。而供試菌株對(duì)貫眾、魚(yú)腥草和金銀花表現(xiàn)為完全耐藥，其次對(duì)0.75g/ml濃度以下的夏枯草，0.5g/ml濃度以下的梔子、百部、黃連和黃柏，以及0.10g/ml濃度以下的艾葉和0.05g/ml濃度的大青葉也表現(xiàn)為耐藥。

表5 15種中草藥在不同濃度下對(duì)仔豬十二指腸源性大腸桿菌的體外抑菌效果（n=4,單位mm）

表5可知：供試菌株只對(duì)1.00g/ml濃度時(shí)的大青葉、連翹、金銀花以及0.50g/ml濃度以上的敗醬草表現(xiàn)為極敏。對(duì)1.00g/ml濃度時(shí)的艾葉和蒲公英，對(duì)0.75g/ml濃度以上的梔子、大青葉和紫草，0.5g/ml濃度以上的金銀花、黃芩，以及0.25g/ml濃度的敗醬草，0.10g/ml濃度以上的連翹均表現(xiàn)為高敏。供試菌株表現(xiàn)為中敏的藥物有1.00g/ml濃度的貫眾和黃柏，0.75g/ml濃度以上的百部、黃連和夏枯草，0.5g/ml濃度的梔子和大青葉，0.25g/ml濃度以上的蒲公英，0.1g/ml濃度以上的黃芩，和0.05g/ml濃度以上的紫草、連翹、敗醬草和金銀花。表現(xiàn)為低敏的藥物有0.75g/ml濃度的艾葉，0.5g/ml濃度的黃連，0.25g/ml濃度的大青葉和0.10g/ml濃度以下的蒲公英。而供試菌株表現(xiàn)為耐藥的中草藥有魚(yú)腥草，0.75g/ml濃度以下的貫眾和黃柏，0.5g/ml濃度以下的艾葉、夏枯草和百部，0.25g/ml濃度以下的梔子和黃連，0.10g/ml濃度以下的大青葉和0.05g/ml濃度的黃芩。

3 討論與結(jié)論

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐青霉素鏈球菌（PRP）目前已成為一些大型綜合醫(yī)院常見(jiàn)的院內(nèi)感染菌，常表現(xiàn)為多重耐藥性[7]；而大腸桿菌是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床常見(jiàn)的病原菌之一，由于該菌一直依靠抗生素進(jìn)行控制，使得耐藥性也越來(lái)越嚴(yán)重。由于耐藥菌株感染而造成疾病蔓延使得畜禽養(yǎng)殖業(yè)損失慘重，同時(shí)抗生素的殘留也越來(lái)越重，藥物的使用壽命越來(lái)越短，防治越來(lái)越困難。為了保證食品安全和生產(chǎn)效益不受影響，提高在高密度下飼養(yǎng)畜禽的抗病力就成為當(dāng)前畜牧工作者的一個(gè)重要課題。不用抗生素提高畜禽的抗病力不僅有利于動(dòng)物健康、動(dòng)物福利和生產(chǎn)效率，而且還可以提高畜禽生產(chǎn)中的微生物安全。

本試驗(yàn)所選用的15味中草藥為臨床用于疾病防治的常用藥物，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室前期驗(yàn)證，在疾病的防治方面有確定的療效，如用于奶牛乳房炎、仔豬腹瀉以及雞葡萄球菌病等的防治方面，都顯示了明顯的優(yōu)勢(shì)。由于中草藥的天然性和多能性的特點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中一方面對(duì)相關(guān)疾病具有防治作用，同時(shí)調(diào)控機(jī)體的平衡，起到調(diào)節(jié)臟腑和陰陽(yáng)平衡的作用，有助于提高畜禽自身的免疫力和生產(chǎn)力，因此利用中草藥防治動(dòng)物疾病，已成為當(dāng)前畜牧獸醫(yī)界一個(gè)熱點(diǎn)課題。

本試驗(yàn)的結(jié)果顯示：不同種類中草藥對(duì)不同菌株的抗菌效果不同，并且對(duì)G+菌株和G-菌株的抑菌效果有明顯的差異，百部、金銀花、魚(yú)腥草、連翹、黃柏、紫草、大青草等7種中草藥對(duì)G+菌株抑菌效果明顯，敗醬草、大青葉、金銀花和連翹則對(duì)大腸桿菌具有明顯的體外抑菌效果。這可能與藥物本身所含成分有關(guān)外，藥物的作用機(jī)制（如影響細(xì)菌細(xì)胞壁或抑制細(xì)菌內(nèi)某些酶如DNA聚合酶、RNA聚合酶等的活性）應(yīng)該發(fā)揮了重要的作用，但這有待于進(jìn)一步探討。而在這15種中草藥之中，對(duì)大腸桿菌的抑菌效果較差的貫眾和魚(yú)腥草，對(duì)G+則具有明顯的抑菌效果，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能與細(xì)菌自身所含的脂多糖、磷脂、蛋白質(zhì)和脂蛋白復(fù)合物組成的三層外胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此在中草藥飼料添加劑的配伍方面，除了分離菌株進(jìn)行生化分析外，還應(yīng)該進(jìn)行藥物敏感性的試驗(yàn)研究。

參考文章：

[1] 陳泳，李洪，張麗華，等.3594株病原菌的分布及耐藥性研究[J].中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2011,11（4）：350-352

[2] 姚冰，彭曉燕，李曉波.2010年抗菌藥物應(yīng)用與細(xì)菌耐藥性分析[J]。中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2011,11（4）：353-356

[3] 許亞茹，鄭秀芬，元小冬，等.神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)院感染患者的病原菌譜及耐藥性研究[J].2010,20（3）：427～429

[4] 佟愛(ài)華，董梅，匡鐵吉.葡萄球菌醫(yī)院感染臨床分布于耐藥率動(dòng)態(tài)變遷特征分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009,9（22）：4314～4317

[5] 羅玲、楊峻，艾地云，等.湖北省部分肉雞場(chǎng)致病性大腸埃希菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]。動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011,32（3）：128-131

[6] 李成葉，袁碩峰，林奕，等.32味祛風(fēng)濕中藥對(duì)2個(gè)分離菌株的體外抑菌作用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010,31（11）：43-46

[7] 周軍，溫紹霞.重癥監(jiān)護(hù)病房與普通病房靜脈導(dǎo)管感染原病菌分布調(diào)查[J].山西醫(yī)藥雜志：2011,40（4）：355-356