郭飛宏,鄭 正,張繼彪(.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,污染控制與資源化研究國家重點實驗室,江蘇 南京 0093；.復(fù)旦大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系,上海 00433)

PCR-DGGE技術(shù)分析塔式蚯蚓生態(tài)濾池微生物群落結(jié)構(gòu)

郭飛宏1,鄭 正2*,張繼彪2(1.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,污染控制與資源化研究國家重點實驗室,江蘇 南京 210093；2.復(fù)旦大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系,上海 200433)

利用PCR-DGGE技術(shù)研究塔式蚯蚓生態(tài)濾池微生物群落結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果表明,微生物的變化與濾池體積大小、水力停留時間和污染物負荷有關(guān),微生物群落結(jié)構(gòu)在不同濾池層中變化較大.12個樣品泳道中的總細菌的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)從0.25變化到1.27,一級濾池微生物多樣性指數(shù)從0.29變化到1.05,二級濾池微生物多樣性指數(shù)從0.75變化到0.97,三級濾池微生物多樣性指數(shù)先從0.87減少到0.25,后由于葡萄糖的加入增加到 1.27.二級濾池出水中葡萄糖的加入,加強了系統(tǒng)內(nèi)微生物的活性,從而三級濾池砂石和青石層細菌條帶變亮變多.經(jīng)過克隆測序和系統(tǒng)發(fā)育樹分析,塔式蚯蚓生態(tài)濾池內(nèi)的微生物多為單細胞菌屬、假單細胞菌屬、革蘭氏陰性菌屬和不可培養(yǎng)桿菌屬,不同細菌條帶在不同級濾池內(nèi)差異變化明顯.

PCR-DGGE；蚯蚓生態(tài)濾池；微生物群落；指數(shù)；菌屬

塔式蚯蚓生態(tài)濾池是利用蚯蚓能夠提高土壤通氣性能和促進有機物分解而設(shè)計的一種新型污水處理工藝,它充分利用了植物、動物和微生物的協(xié)同作用,相比傳統(tǒng)污水處理工藝具有投資省、處理效率高、無污泥產(chǎn)生等優(yōu)點[1].“蚯蚓”在該系統(tǒng)對污染物降解中的作用:一是去除污水中的有機物,二是提高土壤通氣性活化土壤,從而加大土壤富氧程度,間接促進系統(tǒng)內(nèi)的耗氧微生物的活性.但是塔式蚯蚓濾池內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜,以往的研究主要集中在進水、出水等外部影響因素上,沒有對塔式蚯蚓生態(tài)濾池內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)[1]進行研究,使得對污水處理過程中微生物與處理效果關(guān)系性的研究仍處于“黑盒子”狀態(tài).

傳統(tǒng)的微生物生態(tài)學(xué)研究是基于微生物的直接培養(yǎng)來分析環(huán)境中微生物的種群結(jié)構(gòu)及其生態(tài)關(guān)系的,由于自然界中可培養(yǎng)微生物數(shù)量占實際微生物數(shù)量不足 10%,傳統(tǒng)方法顯然不適合微生物群體結(jié)構(gòu)研究.PCR-DGGE技術(shù)不經(jīng)過分離培養(yǎng)技術(shù)而直接對環(huán)境微生物進行分析,克服了傳統(tǒng)微生物分類鑒定法的不足,可以直接可靠的反映出微生物的多樣性 .

本研究利用 PCR-DGGE技術(shù),以實驗平臺上運行 1年的塔式蚯蚓生態(tài)濾池為研究對象,考察了三級塔式蚯蚓生態(tài)濾池中的微生物群落的演變.旨在為工藝運行和濾池內(nèi)微生物的動態(tài)變化之間架起一座溝通橋梁,根據(jù)測得的濾池內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)確定優(yōu)勢菌群進而調(diào)節(jié)工藝參數(shù)提高污水處理效率.

1 材料與方法

1.1 塔式蚯蚓生態(tài)濾池

塔式蚯蚓生態(tài)濾池構(gòu)建于2009年2月中旬,共有三級:一級、二級的尺寸(長×寬×高)0.5m×0.5m×0.6m,三級的尺寸 1.1m×0.65m×1.2m.每級濾池填料包括土壤、細砂、碎青石和鵝卵石,土壤表面均栽種吊鐘柳起到二次布水作用.實驗使用的大平 2號蚯蚓屬于赤子愛勝蚯蚓,主要分布在土壤表層土和中層土中,蚯蚓在土壤中的接種密度為4.63g/L.進水為南京大學(xué)學(xué)生宿舍化糞池出水,采用蠕動泵控制進行間歇進水.水力負荷0.25m3/(m2?d),每天進水6h進水與落干的時間(即濕干比)為1:3.

生活污水首先進入?yún)捬醭?經(jīng)過一段時間的厭氧硝化作用,部分污染物質(zhì)得到降解.厭氧池中的出水通過水泵的作用,分別進入到一級濾池、二級濾池和三級濾池.污染物在多級濾料、蚯蚓和植物的共同作用下得到去除,三級濾池的出水達到國家污水排放的一級A標準.

圖1 塔式蚯蚓生態(tài)濾池的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure diagram of tower earthworm ecology-filter

1.2 樣品采集

分別于2009年11月和2010年6月從塔式蚯蚓生態(tài)濾池土壤層和砂石層取樣.其中一級、二級濾池取樣3份,分別是土壤表層土、中層土和砂石層,三級濾池取樣 6份分別是:土壤表層土、表層下5cm土、中層土、下層土、砂石層和青石層.所有樣品經(jīng)冷凍干燥儀-80℃凍干后,研磨后過 100目塞,樣品分裝放在-20℃保存待分析[3].

1.3 主要試劑

TE緩沖液、二溴乙錠染色劑、1×TAE均為自制,TaqDNA聚合酶和10×Buffer購自寶生物工程(大連)有限公司,擴增引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成,超純水用Millipore公司的Simpicity型超純水機制成,瓊脂糖購自上海生工有限公司,dNTPs和PCR產(chǎn)物DNA Maker購自寶生物工程(大連)有限公司.

1.4 實驗方法

1.4.1 基因組 DNA的提取, DNA的提取采用MOBIO公司的Ultra Clean Soil DNA isolation KIT試劑盒,包括 Bead Solution Tubes、2ml Collection Tubes、Spin Filter Units in 2ml Tubes、IRS solution、Solution S1、Solution S2、Solution S3、Solution S4、Solution S5[4].

1.4.2 巢式PCR擴增,利用16SrDNA V3區(qū)引物對樣品DNA進行巢式PCR擴增,設(shè)計的引物為63F和1387R(一次PCR),338F-GC和518R(二次PCR).

一次PCR擴增條件為94℃預(yù)變性5min,然后94℃變性 45s,55℃退火 1min,72℃延伸 45s共 30個循環(huán),最后在72℃下延伸10min.二次PCR擴增條件為 95℃預(yù)變性 10min,然后 95℃變性 1min,63℃退火2min,72℃延伸1min共30個循環(huán),最后在72℃下延伸10min.采用50μL的反應(yīng)體系,組成為:1μL的DNA模板,4μL的MgCl2,5μL的10×PCR buffer(Mg2+Free),4μL 的 dNTPs,1μL 每種引物,0.25μL的Taq酶,其余用無菌超純水補足至50μL.擴增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測[5].

1.4.3 PCR產(chǎn)物的DGGE分析,制備變性劑尿素濃度梯度 50%～80%,丙烯酰胺凝膠濃度為 10%的變性梯度凝膠電泳(DGGE),電泳電壓 100V,電泳時間 14h,二溴乙錠染色 15min,脫色 25min,圖像在觀測儀中拍照存檔[6].

1.4.4 Shannon-Wiener指數(shù)分析,應(yīng)用凝膠分析軟件Quantity One對掃描所得的DGGE圖譜進行分析,并利用 Shannon多樣性指數(shù)來評價樣品的微生物多樣性.多樣性指數(shù)經(jīng)過長期試驗和推導(dǎo),得出公式:

2．5 慢性病相關(guān)知識來源情況 被調(diào)查小學(xué)生最信任和最喜歡的健康知識來源分別是老師講課和電視，飲食和運動習(xí)慣受家人影響的比例最高。見表5。

式中: Pi=ni/N; ni為峰面積; N為所有峰的總面積.

2 結(jié)果

2.1 總細菌的DGGE圖譜

總細菌的DGGE圖譜如圖2所示總共12個樣品泳道,對2009年11月和2010年6月2次取樣樣品DGGE圖譜進行了比較對比,圖2是圖譜效果較好的一組(2009年11月) .從右往左依次為一級濾池表層土B1、中層土B2、砂石B3,二級濾池表層土B4、中層土B5、砂石B6,三級濾池表層土B7、表層5cm下土B8、中層土B9、下層土B10、砂石B11和碎青石B12.12條樣品泳道均有豐富的條帶,且差異性顯著,其中既有一直保持數(shù)量穩(wěn)定的優(yōu)勢菌種,又有經(jīng)過一、二級濾池逐漸培養(yǎng)起來的優(yōu)勢菌種,還有經(jīng)過多層濾池數(shù)量變化較大的菌種.這說明不同濾池內(nèi)部細菌總?cè)簲?shù)量豐富,在處理生活污水的過程中優(yōu)勢菌種充分發(fā)揮了作用.

圖2 塔式蚯蚓生態(tài)濾池總細菌DGGE分離圖譜Fig.2 Diagram of DGGE pattern in tower earthworm ecology-filter

2.2 總細菌Shannon-Wiener指數(shù)分析

蚯蚓生態(tài)濾池總細菌的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分析見表 1,不同級濾池的生物多樣性差別比較大,這主要與樣品所處的濾池級數(shù)和在同一濾池中所處的位置有關(guān).

2.3 總細菌片段克隆測序分析和菌種測定

將總細菌DGGE中的部分優(yōu)勢條帶進行割膠、克隆、測序分析,在Gen bank中進行比對獲得各優(yōu)勢序列的同源性信息結(jié)果見表 2,細菌系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3.

3 分析與討論

3.1 總細菌DGGE圖譜分析

3.1.1 從濾池角度分析 一級、二級濾池泳道內(nèi)細菌條帶強弱變化小,數(shù)量保持穩(wěn)定;三級濾池泳道內(nèi)細菌變化幅度大、條帶強弱差異顯著,其中砂石層、青石層泳道內(nèi)的細菌數(shù)量和條帶亮度遠優(yōu)于其他泳道.這主要是由于污水首先進入一級和二級濾池,大部分污染物質(zhì)被去除.但前兩級濾池本身體積小,水力停留時間短,細菌代謝較快,差異性不是很明顯.三級濾池體積比較大,水力停留時間長,進水中的污染物質(zhì)含量的減少直接影響了三級濾池表層土、中層土和下層土內(nèi)的細菌條帶較弱.

表1 總細菌Shannon-Wiener生物多樣性指數(shù)分析Table 1 Shannon-Wiener index of biodiversity on various bacteria

表2 微生物群落16SrDNA片斷測序分析結(jié)果Table 2 Result of sequence analysis from16SrDNA phrases in microbe community

圖3 塔式蚯蚓生態(tài)濾池總細菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of various bacteria in tower earthworm ecology-filter

蚯蚓生態(tài)濾池對氨氮去除效果很好,氨氮得到了較好的吸附和硝化,但由于系統(tǒng)溶解氧較高,可利用的有機碳源較少,水流停留時間較短,反硝化受到抑制,硝態(tài)氮大量積累,總氮去除效果較差.為降低蚯蚓生態(tài)濾池出水中的總氮,必須強化濾池的反硝化功能,提高進水C/N比,增加反硝化所需的有機碳源.在二級濾池出水中添加了葡萄糖碳源,加強了系統(tǒng)內(nèi)微生物的活性,促進了反硝化作用[7],第三級濾池的砂石層和青石層細菌條帶數(shù)量多、亮度強.不同濾池內(nèi)微生物的變化受濾池體積大小、污染物負荷多少和水力停留時間長短的影響.

3.1.2 從細菌條帶特征分析 12條泳道細菌條帶差異顯著,條帶b、e代表的菌種在一級、二級和三級濾池內(nèi)一直存在,且數(shù)量變化小,強弱基本保持穩(wěn)定.說明這類菌種很好的適應(yīng)了濾池的環(huán)境,在濾池內(nèi)部生長適宜,對污水中的污染物去除作用突出,屬于優(yōu)勢菌種[8].條帶f、g、i代表的菌種也是一直存在,但是不同濾池該類菌種變化大,規(guī)律不是很明顯.說明該類菌種對污水的特定污染物質(zhì)作用突出,是污水處理中不可缺少的菌種,但不是優(yōu)勢菌種[9].條帶a、c、d、h代表的菌種剛開始并不存在后來才出現(xiàn),并且在三級濾池表現(xiàn)明顯.說明該類菌種在一級、二級濾池作用不明顯,到了三級濾池隨著環(huán)境的改變,外界條件適合該類菌種生存.該類菌種是三級濾池的特定菌種.條帶j所代表的菌種剛開始有,后來消失了.說明該類菌種適宜的外界條件發(fā)生變化,該類菌種從必需菌種發(fā)展到非必需菌種.

3.2 總細菌多樣性指數(shù)分析與討論

從表 1可以看出,總細菌的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)變化較大,這主要是由于濾池中濾料的變化、多級濾池大小的不同和污水水質(zhì)的變化造成的,細菌多樣性指數(shù)變化與理論基本符合.一級濾池 B1、B2、B3和二級濾池 B4、B5、B6樣品泳道細菌多樣性指數(shù)都有逐漸增大的趨勢,這主要是由于污水剛進入濾池時對濾池內(nèi)的微生物產(chǎn)生產(chǎn)生一定沖擊,使得一些不適應(yīng)該污水的微生物生長處于劣勢,生物多樣性指數(shù)下降.一段時間后隨著細菌對污水的“適應(yīng)”,細菌種類和數(shù)量都增加,生物多樣性指數(shù)上升 .三級濾池B7、B8、B9、B10、B11、B12中細菌多樣性指數(shù)先減少后增加,這主要是因為實驗過程中為了提高三級濾池的反硝化作用在二級出水中添加了碳源葡萄糖,充足的營養(yǎng)物為細菌生長提供了適宜的條件,隨著有機物的消耗細菌生長受到抑制,多樣性減少.而后,在三級濾池底部,添加的碳源加強了系統(tǒng)內(nèi)微生物的活性,促進了反硝化作用[11].

3.3 總細菌片段克隆測序分析

根據(jù)表2的總細菌16SrDNA片斷測序分析結(jié)果可知,條帶d、e分別代表了假單胞菌和單胞菌.假單胞菌和單胞菌對有機物、氮、磷均有較強去除作用,同時假單胞菌還能通過反硝化作用強化氮的去除,條帶 d在三級濾池正因為反硝化作用才表現(xiàn)明顯,這與理論相符合[12].條帶f是黃桿菌,i是韋氏球菌均屬于是革蘭氏陰性菌,廣泛存在于污水、土壤中,對有機物、氨氮有一定的去除作用,正因為革蘭氏陰性菌在砂石、青石中分布較少、且對磷、硝態(tài)氮的去除能力有限,才會出現(xiàn)變化幅度大、無規(guī)律的現(xiàn)象.條帶 g屬于芽苞桿菌,廣泛存在于自然界中屬于腐生或寄生菌類,是污水處理中不可缺少的菌屬.條帶a、c、h進行對比分析,不能確定菌屬.但通過Gen bank對比分析可知,條帶 a的相似菌屬來源于活性污泥反應(yīng)器中的底泥,條帶 c的相似菌屬來源于固體顆粒表層,條帶 h的相似菌屬來源于生物濾料池中[13],與塔式蚯蚓生態(tài)濾池的菌屬來源環(huán)境基本吻合.

4 結(jié)論

4.1 塔式蚯蚓生態(tài)濾池中微生物群落的變化與濾池體積大小、水力停留時間和污染物負荷等因素有關(guān),不同級的濾池和同級不同濾料層內(nèi)的微生物多樣性變化差異較大,一級和二級濾池生物多樣性從上至下逐漸增多,三級濾池微生物多樣性先減少后增多.

4.2 塔式蚯蚓生態(tài)濾池中細菌條帶差異顯著,一、二、三級濾池內(nèi)既有一直保持穩(wěn)定變化不大的細菌條帶b、e,又有后來逐漸增加增強的細菌條帶 a、c、d、h,還有系統(tǒng)運行過程中消失的細菌條帶 j.二級濾池出水中葡萄糖的添加,加強了系統(tǒng)內(nèi)微生物的活性,細菌條帶普遍變多變亮.

4.3 細菌片段克隆測序發(fā)現(xiàn),塔式蚯蚓生態(tài)濾池內(nèi)的細菌多為單細胞菌屬、假單細胞菌屬、革蘭氏陰性菌屬和不可培養(yǎng)桿菌等,它們對污水中污染物質(zhì)的去除發(fā)揮了重要作用.

[1] 方彩霞,羅興章,鄭 正,等.改進型蚯蚓生態(tài)濾池處理生活污水研究 [J]. 中國給水排水, 2009,16(1):115-121.

[2] 崔雨新,王小明.分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境生物學(xué)中的應(yīng)用 [J].自然雜志, 2001,21(5):295-301.

[3] 俞毓馨,吳國慶,孟憲庭.環(huán)境工程微生物檢驗手冊 [M]. 北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社, 1990:63-79.

[4] 邊才苗,施時迪.土壤細菌DNA的抽提及分析 [J]. 浙江師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2002,25(1):56-61.

[5] 佘躍惠,張 凡. PCR-DGGE方法分析原油儲層微生物群落結(jié)構(gòu)及種群多樣性 [J]. 生態(tài)學(xué)報, 2005,22(2):97-104.

[6] 馬悅欣, Jeremy Webb. 變性梯度凝膠電泳(DGGE)在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用 [J]. 生態(tài)學(xué)報, 2003,7(8):77-82.

[7] 孫寓姣,左劍惡,陳莉莉.同時產(chǎn)甲烷反硝化顆粒污泥中微生物群落結(jié)構(gòu) [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2007,12(1):65-74.

[8] 高大文,李昕芯,安 瑞,等.不同DO下MBR內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)與運行效果關(guān)系 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2010,30(2):209-215.

[9] 陳 誼,孫寶盛,黃 興.膜生物反應(yīng)器中不同階段微生物群落結(jié)構(gòu)演變的研究 [J]. 環(huán)境工程學(xué)報, 2009,6(3):1027-1028.

[10] 劉書宇,馬 放,張建祺.景觀水體富營養(yǎng)化模擬過程中藻類演替及多樣性指數(shù)研究 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2007,23(2):125-130.

[11] 羅海峰,齊鴻雁,張洪勛. PCR-DGGE技術(shù)在農(nóng)田土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用 [J]. 生態(tài)學(xué)報, 2003,5(08):43-51.

[12] 王蔭榆,李會榮,郭本恒.應(yīng)用變性梯度凝膠電泳和16S rDNA序列分析對 kefir粒中細菌多樣性的研究 [J]. 微生物學(xué)報,2006,17(2):124-130.

[13] 陳 堅,吳忠興,鄭偉文. 22種絲狀異型胞固氮藍細菌的 16S rDNA的 PCR-RFLP分析 [J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2002,35(5):89-97.

致謝：在試驗和論文撰寫過程得到唐開平女士的支持,在此表示感謝.

Research on microbe community in tower earthworm ecology-filter by PCR-DGGE.

GUO Fei-hong1, ZHENG Zheng2*, ZHANG Ji-biao2(1.State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment,Nanjing University, Nanjing 210093, China；2.Department of Environmental Science and Engineering, Fudan University,Shanghai 200433, China). China Environmental Science, 2011,31(4)：597～602

Change of microbe community in tower earthworm ecology-filter was studied in this research with PCR-DGGE technology (polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis). These results showed that: the change of microbe community was obvious and linked with hydraulic resident time、pollutation burden and the volume of filters.Meanwhile, Shannon-Wiener Index of biodiversity increased from 0.25 to 1.27 in an all-round way, including 0.29～1.05 in the first filter, 0.75～0.97 in the second filter and 0.87～0.25～1.27 caused by some glucose added into influent in the last filter. Under the same reason, the activity and light of denitrifying bacteria were intensified on bluestone and gravel layers.After analysis of cloning sequencing and phylogenetic tree, most of the inferred bacteria were Sphingomonas,Pseudomonas, Gram-negative bacteria and uncultured Bacillus and changed evidently in different filters.

PCR-DGGE；earthworm ecology-filter；microbe community；index；bacteria

X705

A

1000-6923(2011)04-0597-06

2010-07-10

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2008ZX07101-004)

* 責(zé)任作者, 教授, zzhenghj@fudan.edu.cn

郭飛宏(1986-),男,山東濟寧人,碩士研究生,主要從事流域面源水污染控制研究.發(fā)表論文4篇.