黃慧珍,程 凱,許 敏,趙以軍(華中師范大學(xué)城市水環(huán)境生態(tài)學(xué)湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430079)

基于g23基因的武漢東湖T4類浮游病毒遺傳多樣性

黃慧珍,程 凱,許 敏,趙以軍*(華中師范大學(xué)城市水環(huán)境生態(tài)學(xué)湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430079)

選取武漢東湖的2個子湖——郭鄭湖和廟湖,分別在冬季和夏季采樣,對T4類浮游病毒的g23基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后,隨機(jī)挑選克隆子進(jìn)行測序.結(jié)果表明,共得到46條有效序列,根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)其明顯分為6個組,顯示出較高的多樣性且具有明顯的時空差異,說明富營養(yǎng)化水平的差異和季節(jié)變化將對浮游病毒的種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響.僅部分g23序列與海洋T4類浮游病毒同源性較高,另一部分序列則可能代表了淡水富營養(yǎng)化水體中特有的浮游病毒類群.人為干擾會明顯影響某些淡水水體中T4類浮游病毒的遺傳多樣性.

g23基因；東湖；T4；浮游病毒；遺傳多樣性

浮游病毒泛指懸浮于水體中的各種病毒,包括噬菌體、噬藻體和真核藻類病毒等[1].浮游病毒個體雖然微小,卻是水體微生物群落中豐度最高的有機(jī)成分,其在水體生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)重要地位[2].國際上對浮游病毒多樣性的研究是在20世紀(jì)80年代以后興起,并且大部分研究都是針對海洋水體[3-4],以及稻田土壤和灌溉水[5].我國相關(guān)的研究剛剛起步,對淡水湖泊中的浮游病毒的多樣性研究還集中在電鏡觀察和脈沖場電泳等方法

[6-8].劉艷鳴等[8]對東湖浮游病毒研究發(fā)現(xiàn),其病毒基因組大小以 20～60kb的核酸帶為強(qiáng),這符合噬菌體和噬藻體的基因組主要范圍.證實了東湖浮游病毒的優(yōu)勢類群為噬菌體和噬藻體.

g23基因編碼 T4類噬菌體的主要衣殼蛋白(MCP)gp23(該蛋白由 521個氨基酸構(gòu)成),在應(yīng)用全球海洋采樣(GOS)研究海洋浮游病毒宏基因組學(xué)的過程中,被發(fā)現(xiàn)是最具有代表性的蛋白質(zhì)家族[3].Jia等[9]也建立了灌溉期間日本稻田表層土樣的g23克隆子文庫,由于土壤與海洋環(huán)境條件的明顯不同,其T4類浮游病毒的種類也大不相同.

鑒于目前國內(nèi)外對淡水湖泊浮游病毒研究尚少,國內(nèi)對浮游病毒的遺傳多樣性研究仍為空白,本實驗以T4類浮游病毒的g23基因為對象來研究淡水富營養(yǎng)化水體中T4類浮游病毒的遺傳多樣性,不但有助于填補(bǔ)這方面的研究空白,而且將有助于推測淡水浮游病毒的生態(tài)功能及其對淡水水體富營養(yǎng)化的響應(yīng)機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 水樣采集與處理

選取武漢東湖的 2個子湖——郭鄭湖和廟湖,分別代表輕度富營養(yǎng)化和重度富營養(yǎng)化湖泊.在2009年3月8日和8月5日上午,用有機(jī)玻璃采水器采取郭鄭湖和廟湖表層水樣,裝入棕色玻璃瓶,用 1%氯仿或戊二醛固定,4℃保存,一周內(nèi)進(jìn)行濃縮處理.

冬季采集的水樣須先濾過孔徑為0.22μm的混合纖維膜,再用 TFF膜包(PALL公司,100kD),進(jìn)行反沖超濾濃縮[17],1L水樣最終濃縮為 20～30mL,分裝入1.5mL塑料離心管,-20℃保存待用.夏季采集的水樣在濾過0.22μm的混合纖維膜前,先用普通定性濾紙過濾,其余步驟同冬季水樣.

1.2 方法

1.2.1 浮游病毒總 DNA提取 取 600μL病毒濃縮液,加入粗制的DNase和RNase,使終濃度均為 1μg/mL,室溫放置 30～60min,8000r/min 離心5min,上清轉(zhuǎn)入新的塑料離心管,加入蛋白酶k和SDS,使終濃度分別為50μg/mL和0.5%,56℃裂解1～3h,8000r/min離心 5min,上清轉(zhuǎn)入新的塑料離心管,加入等體積飽和平衡酚,顛倒混勻,8000r/min離心 5min,上清轉(zhuǎn)入新的塑料離心管;加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),顛倒混勻,8000r/min離心 5min,上清轉(zhuǎn)入新的塑料離心管;加入等體積氯仿:異戊醇(24:1),顛倒混勻,8000r/min離心 5min,上清轉(zhuǎn)入新的塑料離心管;加入 50μL3M 醋酸鈉和 1000μL 冰無水乙醇,-20℃沉淀過夜;13200r/min離心 15min,用預(yù)冷的 70%乙醇洗滌兩次,室溫干燥.用 20～30μL TE溶解30min,1%瓊脂糖電泳檢查.提取的DNA放于-20℃保存待用.

1.2.2 PCR擴(kuò)增 50μL擴(kuò)增體系中加入 10×Buffer 5μL,15mmol Mg2+3μL,10mmol dNTP 1μL,5U Taq 酶 0.25μL,上下游引物 10mmol各1μL,模板 DNA6μL.使用的程序是 94℃預(yù)變性5min,30個循環(huán)的 94℃變性 45s,50℃退火 60s,72℃延伸45s,72℃終延伸10min.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物.所用的引物為 MZIA1bis:5′-G ATATTTGIGGIGTTCAGCCIATGA-3′,MZIA6:5′-CGCGGTTGATTTCCAGCATGATTTC-3′[4](inv itrogen公司合成),能擴(kuò)增出T4類浮游病毒的g23基因中450bp的片段.

1.2.3 克隆測序 使用 PMD18-T載體試劑盒(takara公司),隨機(jī)挑選10～20個陽性克隆,交由金斯瑞科技南京有限公司測序.

1.2.4 分析 使用 DNAstar5.0軟件包進(jìn)行序列分析,用 mega4.0進(jìn)行組內(nèi)和組間發(fā)散度分析、CLUSTALW排序以及進(jìn)化樹的建立(NJ法).

2 結(jié)果與分析

郭鄭湖和廟湖冬夏兩個季節(jié)共 4個水樣,經(jīng)隨機(jī)克隆共得到 46條序列,具體如下(Genebank序列號為HM005246-HM005291):

表1 序列來源Table 1 Sources of sequences

表2 組間發(fā)散度Table 2 Estimates of evolutionary divergence over sequence pairs between groups

根據(jù)組內(nèi)平均發(fā)散度計算結(jié)果得到:冬季郭鄭湖為0.365,廟湖為 0.411;夏季郭鄭湖為 0.517,廟湖為 0.342.郭鄭湖夏季水體的病毒之間的距離最大,即多樣性最大,廟湖夏季水體的病毒之間距離最小,多樣性最小.

每個水樣所得病毒序列作為一個整體,兩兩相比較發(fā)散度的計算見表 2,其結(jié)果顯示廟湖冬季與夏季病毒之間的差異最小,而郭鄭湖兩季之間的差異最大.

圖1 本研究所得序列與T4和典型海洋噬菌體[4]的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the sequences we obtained, T4 and the typical marine bacteriophages[4]

3 討論

3.1 基于g23基因序列的東湖T4類浮游病毒進(jìn)化關(guān)系分析

根據(jù)本研究所得的 g23序列與部分已報道的海洋噬菌體T4類浮游病毒的g23序列所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1),可將本研究所得序列分為6組(GP1～6)(具體分組情況如圖 2所示).由圖 2可見:GP1、GP2、GP5和 GP6的進(jìn)化方向明顯不同于海洋T4類浮游病毒,而GP 3(包括3條序列)和GP 4(包括24條序列)則明顯與海洋起源的噬菌體的親緣關(guān)系較近,很可能與海洋噬菌體有共同的起源,說明淡水噬菌體與海洋噬菌體可能來源于共同的祖先[10].GP 4和GP 6分別包括有24和10條序列,共占所有序列的73.9%,均涵蓋本次研究中全部4個來源的樣品,是東湖中T4類浮游病毒的主要類群,其中,由于GP6與海洋噬菌體的親緣關(guān)系更遠(yuǎn),具有更加獨立的進(jìn)化途徑,很可能代表淡水富營養(yǎng)化水體中T4類浮游病毒的典型類群;GP 1包括 3條序列(5-8,10-2,10-14),均來源于兩個湖泊的冬季水樣,很可能是冬季典型序列,并且該枝與其他所有序列的親緣關(guān)系都非常遠(yuǎn);GP 2分為2個進(jìn)化方向,包括4條序列(s5-9,s5-11,s10-9,s10-10),均來源于兩個湖泊的夏季水樣,很可能都是夏季典型序列;GP 5僅包括兩個序列(s10-7,s10-8),均來自廟湖夏季樣品.

有報道表明海洋噬菌體群落的多樣性非常高[11-12],Ursula Dorigo等[10]對淡水噬菌體g20基因的研究結(jié)果也顯示出淡水噬菌體的多樣性十分豐富,本實驗從來自2個湖區(qū)的46條序列中即得到了6個明顯的類群,顯示東湖中T4類噬菌體也具有很高的遺傳多樣性.這可能是由于病毒和宿主間或感染相同宿主的病毒間的基因交換所導(dǎo)致[12-13].另一個假說認(rèn)為,噬藻體群落的多樣性可能與宿主群落多樣性有關(guān)[14-16].

3.2 T4類浮游病毒遺傳多樣性的時間變化

3.2.1 郭鄭湖 T4類浮游病毒遺傳多樣性的時間變化 郭鄭湖為輕度富營養(yǎng)化,且受人為干擾較小(相對于廟湖而言).在系統(tǒng)發(fā)育樹上(圖1),該湖冬季序列與夏季界限明顯,幾乎完全位于不同的分支上,并且冬季序列的分布更加集中,多樣性較小,而夏季序列則占據(jù)較多分支,多樣性更豐富,這與組內(nèi)發(fā)散度計算結(jié)果也一致.可能由于夏季浮游病毒數(shù)量遠(yuǎn)高于冬季,且冬夏兩季宿主類型的不同,導(dǎo)致浮游病毒的種類區(qū)別較大[18-19].

圖2 本研究所得序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the sequences we obtained

3.2.2 廟湖 T4類浮游病毒遺傳多樣性的時間變化 廟湖為重度富營養(yǎng)化,2009年 6～10月期間,該湖形成了嚴(yán)重的銅綠微囊藻水華.與郭鄭湖不同的是,廟湖冬夏兩季的 g23序列之間并沒有明顯的界限,它們在進(jìn)化樹上分布相對均勻(圖1),冬夏兩季的病毒種類之間并無明顯差異.由于廟湖毗鄰居民區(qū)和餐飲點,常年受到嚴(yán)重的人為干擾,人為因素將對浮游病毒的多樣性產(chǎn)生明顯影響,并在有可能一定程度上掩蓋自然(季節(jié))變化對浮游病毒的影響[20],因此該湖兩個季節(jié)浮游病毒優(yōu)勢種之間的親緣關(guān)系很近.另外,根據(jù)組內(nèi)發(fā)散度結(jié)果,廟湖夏季病毒多樣性比冬季小,很可能是因為該水體夏季發(fā)生了嚴(yán)重的銅綠微囊藻水華,導(dǎo)致宿主生物的多樣性下降,從而使浮游病毒的多樣性隨之下降.

4 結(jié)論

4.1 隨機(jī)克隆的方法用來檢驗淡水水體浮游病毒多樣性是可行的.

4.2 淡水富營養(yǎng)化水體中的 T4類浮游病毒的遺傳多樣性較高且具有明顯的時空差異,說明富營養(yǎng)化水平的差異和季節(jié)變化將影響浮游病毒的種群結(jié)構(gòu).

4.3 淡水富營養(yǎng)化水體中,僅部分g23序列與海洋 T4類浮游病毒同源性較高,另一部分序列則可能代表了淡水富營養(yǎng)化水體中特有的T4類浮游病毒.

4.4 人為干擾會明顯影響 T4類浮游病毒的遺傳多樣性.

[1] Wommack K E, Ravel J, Hill R T, et al. Population dynamics of Chesapeake Bay virioplankton: total-community analysis by pulse-field gel electrophoresis [J]. Appl. Environ. Microbiol.,1999,65(1):231-240.

[2] Bergh O, orsheim K Y, Bratbak B G, et al. High abundance of viruses found in aquatic environments [J]. Nature, 1989,340:467-468.

[3] Andre′ M Comeau, Henry M Krisch. The capsid of the T4 phage superfamily: the evolution, diversity, and structure of some of the most prevalent proteins in the biosphere [J]. Mol. Biol. Evol.,2008,25(7):1321-1332.

[4] Filee J, Tetart F, Suttle C A, et al. Marine T4-type bacteriophages,a ubiquitous component of the dark matter of the biosphere [J].PNAS, 2005,102(35):12471-12476.

[5] Fujii T, Nakayama N, Nishida M, et al. Novel capsid genes (g23)of T4-type bacteriophages in a Japanese paddy field [J]. Soil Biol.Biochem., 2008,40(5):1049-1058.

[6] Liu Yan-Ming, Zhang Qi-Ya, Yuan Xiu-Ping. Studies on abundance and morphological diversity of virioplankton in the Donghu Lake, Wuhan [J]. Acta Hydrobiol. Sinica, 2005,29(1):1-6.

[7] Liu Y M, Yuan X P, Zhang Q Y. Spatial distribution and morphologic diversity of virioplankton in Lake Donghu, China [J].Acta OECOL., 2006,29(3):328-334.

[8] 劉艷鳴,張奇亞.利用脈沖場凝膠電泳測定東湖浮游病毒基因組的大小 [J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版), 2005,51(s2):238-240.

[9] Jia Z, Ishihara R, Nakajima Y, et al. Molecular characterization of T4-type bacteriophages in a rice field [J]. Environ. Microbiol.,2007,9:1091-1096.

[10] Ursula Dorigo, Stéphan Jacquet. Cyanophage diversity, inferred from g20 gene analyses, in the largest natural lake in France,Lake Bourget [J]. Appl. Environ. Microbiol., 2004,70(2):1017-1022.

[11] Marston M F, Sallee J L. Genetic diversity and temporal variation in the cyanophage community infesting marine Synechococcus species in Rhode Island’s coastal water [J]. Appl. Environ.Microbiol., 2003,69:4639-4647.

[12] Zhong Y, Chen F, Wilhelm S W, et al. Phylogenetic diversity of marine cyanophage isolates and natural virus communities as revealed by sequences of viral capsid assembly protein gene g20[J]. Appl. Environ. Microbiol., 2002,68:1576-1584.

[13] Sullivan M B, Waterbury J B, Chisholm S W. Cyanophages infecting the oceanic cyanobacterium Prochlorococcus [J]. Nature,2003,424:1047-1051.

[14] Becker S, Fahrbachl M. Quantitative tracing, by Taq nuclease assays, of a Synechococcus ecotype in a highly diversified natural population [J]. Appl. Environ. Microbiol., 2002,68:4486-4494.

[15] Urbach E, Scanlan D J, Distel D L, et al. Rapid diversification of marine picoplankton with dissimilar light harvesting structures inferred from sequences of Prochlorococcus and Synechococcus(cyanobacteria) [J]. J. Mol. Evol., 1998,46:188-201.

[16] Crosbie N D, P?ckl M, Weisse T. Dispersal and phylogenetic diversity of nonmarine picocyanobacteria, inferred from 16S rRNA gene and cpcBA-intergenic spacer sequences analyses [J].Appl. Environ. Microbiol., 2003,69:5716-5721.

[17] 羅文清,鞠 川,程 凱,等.一種濃縮噬藻體的反沖超濾技術(shù)[J]. 中國病毒學(xué), 2003,18(4):397-400.

[18] Wommack K E, Hill R T, Kessel M, et al. Distribution of viruses in the ChesapeakeBay [J]. Appl. Environ. Microbiol., 1992,58:2965-2970.

[19] Suttle C A, Cyanophages and their role in the ecology of cyanobacteria. In: Brian A, Malcolm P, eds. The ecology of cyanobacteria. Netherlands Dordrecht: Kluwer academic publishers, 2000.563-589.

[20] Jiao N Z, Zhao Y L, Luo T W, et al. Natural and anthropogenic forcing on the dynamics of virloplankton in the yangtze river estuary [J]. J Mar. Biol. Assoc. UK., 2006,86(3):543-550.

Genetic diversity of T4 virioplankton, inferred from g23 gene, in Wuhan Donghu Lake.

HUANG Hui-zhen, CHENG Kai, XU Min, ZHAO Yi-jun*(Hubei Key Laboratory of Urban Water Environmental Ecology, Central China Normal University, Wuhan 430079, China). China Environmental Science, 2011,31(3)：443～447

2 sub-lakes in Donghu Lake: Guozheng Lake and Miaohu Lake were chosen, and sampled seperately in winter and summer. g23 gene of T4 virioplankton was amplified, randomly sequenced certain clones. 46 sequences were got.Phylogenetic analysis showed that these sequences fell into 6 independent groups and exihibited high diversity. The phylogenetic analysis also suggests that: 1) the eutrophication level and season change have something to do with the structure of virioplankton community; 2) only part of the sequences are closely related to marine T4 virioplankton, so the others may represent eutrophicated freshwater virioplankton; 3) anthropogenic forcing can obviously influence the genetic diversity of T4 virioplankton in certain freshwaters.

g23 gene；Donghu Lake；T4；virioplankton；genetic diversity

X172

A

1000-6923(2011)03-0443-05

2010-08-08

國家自然科學(xué)基金資助項目(30670088);國家科技重大專項資助項目(2009ZX07105-001);華中師范大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費資助項目

* 責(zé)任作者, 教授, zhaoyj@mail.ccnu.edu.cn

黃慧珍(1984-),女,湖北武漢人,碩士研究生,研究方向為水體浮游病毒遺傳多樣性鑒定.發(fā)表論文1篇.