王飛，農(nóng)云軍，蘇流坤，竇文淵，石燕麗

（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510070）

高效液相色譜法測(cè)定奶粉中卵磷脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

王飛，農(nóng)云軍，蘇流坤，竇文淵，石燕麗

（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510070）

建立了奶粉中卵磷脂（PC）的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)的測(cè)定方法，奶粉經(jīng)去蛋白-液液萃取-富集濃縮超濾后進(jìn)高效液相色譜儀，采用硅膠色譜柱，正己烷-異丙醇-水(體積比31∶62︰7)流動(dòng)相體系，等度洗脫能夠快速有效地分離奶粉中的卵磷脂。線性范圍為0.020～1.60 g/L,相關(guān)系數(shù)為0.9996,檢出限為15 mg/L,加標(biāo)回收率為95.2%～96.8%。該方法用于實(shí)際樣品的測(cè)定，結(jié)果令人滿意。

高效液相色譜；蒸發(fā)光散射檢測(cè)；奶制品；卵磷脂

0 引言

磷脂酰膽堿（PC）俗稱卵磷脂，具有重要的生理功能和乳化性能，被廣泛應(yīng)用于食品、保健品和醫(yī)藥等行業(yè)[1]。在奶粉行業(yè)中，卵磷脂作為一種乳化劑，被噴涂在奶粉表面可顯著增強(qiáng)其親水性，增加奶粉的分散性，達(dá)到速溶的目的，同時(shí)卵磷脂又起到了營(yíng)養(yǎng)保健的作用。但是卵磷脂作為一種食品添加劑，噴涂于奶粉中時(shí)一般允許添加量小于0.4%[1]，所以建立一種快速、靈敏、有效的測(cè)定奶粉中卵磷脂含量的方法在保障食品安全方面有重要意義。

目前卵磷脂的檢測(cè)方法主要有分光光度法[2-4]、薄層色譜法[5，6]、熒光分光光度法[7]、核磁共振法[8]和高效液相色譜法[9-11]等。近年來(lái)，對(duì)保健品中卵磷脂的分析研究報(bào)道較多，但對(duì)于奶粉中卵磷脂的測(cè)定還沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，文獻(xiàn)報(bào)道的只有分光光度法[2]，步驟繁瑣復(fù)雜。本文建立了奶粉中卵磷脂含量的高效液相色譜測(cè)定法,可以滿足實(shí)際樣品分析的要求，為從事食品安全檢測(cè)人員提供了一定的參考信息，為制定統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器和試劑

LC-20A液相色譜儀（包括二元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器、控溫箱、控制系統(tǒng)）；Alltech-2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；島津LC solution色譜工作站。磷脂酰膽堿、蛋白酶、正己烷、異丙醇均為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 色譜條件

色譜柱:UltimateTMSiO(4.6×250 mm,2.5 μm)；流動(dòng)相：正己烷-異丙醇-水(體積比31∶62∶7)，柱溫為35℃；流速為1.0 mL/min。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器氮?dú)饬魉?.6 L/min,漂移管溫度80℃。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取磷脂酰膽堿50 mg,置于25 mL容量瓶,用正己烷-異丙醇（體積比為1︰1）超聲溶解定容，配置成質(zhì)量濃度為2.00 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)工作液：取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，5.0，6.0 mL分別用正己烷-異丙醇（體積比為1︰1）稀釋至10 mL,配置成質(zhì)量濃度為20，40，80，160，320，640，1000，1200 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理

精密稱取樣品10.0 g，加入適量水溶解，再加入蛋白酶除去蛋白，過(guò)濾，濾液置于分液漏斗中，用正己烷萃取3次，合并濾液和洗液，減壓蒸餾正己烷至干，殘?jiān)谜和?異丙醇（體積比為1︰1）溶解定容5.00 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的提取純化和富集

奶粉成分十分復(fù)雜，如果不進(jìn)行提取純化，會(huì)很大程度地干擾結(jié)果的測(cè)定，因此我們必須要把樣品的前處理做好，才能保證卵磷脂被有效地分離。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，分析得到的譜圖，最終確定樣品先用適量的蛋白酶去除蛋白，離心過(guò)濾后得到的上清液再用正己烷萃取3次，合并濾液和洗液，再減壓蒸餾進(jìn)行濃縮，最后殘?jiān)谜和?異丙醇（體積比為1︰1）溶解定容5.00 mL。

2.2 色譜條件的選擇和優(yōu)化

卵磷脂的紫外吸收比較弱，用紫外檢測(cè)器在205 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)干擾物質(zhì)多，結(jié)果不穩(wěn)定。本文采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）這種質(zhì)量型檢測(cè)器，其響應(yīng)取決于被分析質(zhì)粒的數(shù)量和大小，在不含共軛結(jié)構(gòu)或無(wú)紫外吸收物質(zhì)的分析中具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)，避免了卵磷脂用紫外檢測(cè)僅限于極短波長(zhǎng)處干擾物質(zhì)大的缺陷。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，反復(fù)摸索實(shí)驗(yàn)條件最終確定采用正相色譜柱，以正己烷-異丙醇-水體系作為流動(dòng)相，溶劑背景噪聲最低。

圖1 卵磷脂高效液相色譜

改變流動(dòng)相體系中正己烷和異丙醇的比例，對(duì)卵磷脂的峰形和出峰時(shí)間都有一定的影響，加大異丙醇的比例可以改善峰形，但卻延長(zhǎng)了分析時(shí)間，結(jié)果表明，采用正己烷-異丙醇的體積比為31︰62時(shí)最為合適。流動(dòng)相體系中水的加入量主要影響卵磷脂的出峰時(shí)間，增加水的加入量，則使卵磷脂出峰時(shí)間加快。但是若卵磷脂出峰時(shí)間太快，目標(biāo)峰和雜質(zhì)的分離度會(huì)降低，不利于定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正己烷-異丙醇-水的體積比為31∶62︰7效果最好，色譜峰對(duì)稱性好，保留時(shí)間適中，適用于定量分析（見(jiàn)圖1）。

2.3 線性范圍和檢出限

取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在選定的色譜條件下測(cè)定，以峰面積S的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量M的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，得線性回歸方程為ln S=9.679+1.551ln M,相關(guān)系數(shù)r為0.9996。線性范圍為0.020～1.60 g/L,檢出限為15 mg/L（S/N=3）。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

用質(zhì)量濃度為1.00 g/L的卵磷脂標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6針，保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.15%和1.12%。

2.5 平行性實(shí)驗(yàn)

按照“1.4”方法處理方法，取某品牌奶粉均勻取樣6份，按照上述色譜測(cè)定條件對(duì)其中的卵磷脂含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.93%。

表1 平行性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

取適量含卵磷脂的奶粉樣品，在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，按照“1.4”方法處理樣品，同時(shí)按加入本底平均值50%～150%的標(biāo)準(zhǔn)品做回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果（n=5）

3 結(jié)論

本文采用HPLC-ELSD方法測(cè)定奶粉中卵磷脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并按照方法學(xué)要求對(duì)方法的線性范圍、檢出限、精密度、重現(xiàn)性以及加標(biāo)回收率等參數(shù)進(jìn)行了確定。該方法分析時(shí)間短（約20 min），靈敏度高，該方法用于實(shí)際樣品的測(cè)定，結(jié)果令人滿意,為從事食品安全檢測(cè)人員提供了一定的參考信息，在保障食品安全方面有著重要的意義。

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Determination of milk-powder Phosphatidycholine by high performance liquid chromatography

WANG Fei,NONG Yun-jun,SU Liu-kun,DOU Wen-yuan,SHI Yan-li
(Guangdong Key Laboratory of Emergency Chemical Test,China National Analytical Center,Guangzhou 510070,China)

A method for the determination of milk-powder Phosphatidycholine（PC）by HPLC-ELSD was developed.PC in milk-powder was successfully separated on a SiO chromatography column,using hexane-isopropanol-water(31∶62∶7,v/v/v)as mobile phase after disposing protein,liquid-liquid extraction and concentration.The linear detection range was 0.020～1.60 g/L(r=0.9996)and the limit of detection(LOD)was 15 mg/L.The recovery was in the range of 95.2%～96.8%.The results of the actual sample indicated the method was accurate and reproducible.

high performance liquid chromatography;evaporative light scatter detector;milk-powder;phosphatidycholine

TS252.7

A

1001-2230（2011）03-0053-03

2010-11-08

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(7300055)。

王飛(1979-)，女，助理研究員，從事食品與環(huán)境分析檢測(cè)。