鮑琳琳，鄧 巍，孫麗華，高 虹，盧 葳，秦 川

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.法國巴黎第五大學(xué)腫瘤免疫治療研究中心)

AT-2滅活HIV-1病毒及純化回收鑒定

鮑琳琳1，鄧 巍1，孫麗華1，高 虹1，盧 葳2，秦 川1

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.法國巴黎第五大學(xué)腫瘤免疫治療研究中心)

目的 制備具備完整空間構(gòu)型且純度在90%以上的滅活HIV-1病毒，用于HIV疫苗研究。方法應(yīng)用化學(xué)制劑2，2’-dithiodipyridine(aldrithiol-2;AT-2)滅活HIV-1病毒，對(duì)滅活的病毒超速離心濃縮并洗滌去除滅活用的化學(xué)制劑AT-2。采用分子篩技術(shù)去除滅活病毒中殘存的雜質(zhì)蛋白質(zhì)。結(jié)果 250 μmol/L AT-2與HIV-1 37℃作用1 h可以徹底滅活病毒的感染性，同時(shí)保留病毒的免疫原性。滅活的病毒純化后檢測不到AT-2的殘留，檢測牛血清蛋白殘余量低于50 ng/mL。結(jié)論 滅活的HIV-1病毒經(jīng)過純化后純度達(dá)到95.6%，可以滿足作為HIV疫苗研究的免疫刺激劑的使用要求。

AT-2;滅活病毒;純化

傳統(tǒng)的病毒滅活方法有加熱滅活或者應(yīng)用一定濃度的甲醛液滅活，這些方法通常會(huì)破壞病毒的空間結(jié)構(gòu)從而改變病毒的抗原性，滅活的病毒多作為免疫原用于制備疫苗。HIV病毒在多年的研究中常采用加熱的方法滅活，滅活后的病毒與小片段的多肽在體外刺激試驗(yàn)中比較，多肽具有更好的刺激活性，但是體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果正好相反。造成這種結(jié)果的原因是多方面的，這與病毒的構(gòu)型改變影響了滅活病毒的免疫原性有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道用化合物2，2’-dithiodipyridine(aldrithiol-2，AT-2) 共價(jià)修飾HIV病毒核衣殼(NC)蛋白中的鋅指結(jié)構(gòu)，從而滅活其感染性，這種滅活方法保持了病毒表面的病毒和宿主細(xì)胞來源的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的完整性。本研究是應(yīng)用這種化學(xué)制劑將HIV-1病毒滅活，對(duì)滅活的病毒加以純化已達(dá)到能夠進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)的純度，為進(jìn)一步研究HIV免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 病毒：HIV病毒來自于 HIV病人血漿，由PBMC細(xì)胞培養(yǎng)后收集上清液，存放于 -80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器設(shè)備：XK16/70柱(Pharmacia GE)，GC-17氣相色譜儀，液相色譜儀(Bio-Rad)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，渦旋振蕩器 LDZ5-2，分析天平，AR1140萬分之一，低速離心機(jī)，生物安全柜，-80℃冰箱。

1.1.3 主要試劑及耗材：AT-2(Roche公司)，PBS，20%乙醇，Sephacry S-1000 super fine(Pharmacia GE)，30%丙烯酰胺混合液，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)，10%過硫酸銨，分離膠緩沖液(1.5 mol/L pH8.8 Tris-HCL緩沖液)，2×SDS凝膠上樣緩沖液，5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，轉(zhuǎn)膜緩沖液，10×TBS，TBS/T洗液，封閉液，底物液，SDS-PAGE蛋白電泳：采用Tris-甘氨酸-SDS-PAGE。羊抗人IgG辣根酶標(biāo)記 (Jackson)，Mark Prestain protlander(Invitrogen)，ecl染色劑(中山公司)。PerkinElmer Life Sciences，Inc.，HIV-1 p24 ELISA試劑盒。定量檢測牛血清白蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒(無錫博生醫(yī)用技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 滅活HIV病毒：使用二甲基亞砜將AT-2的濃度調(diào)配到250 μmol/L，在37℃條件下，將溶解的AT-2滴加入待滅活的HIV病毒，邊滴加邊搖勻。滴加完畢后在37℃條件下反應(yīng)1 h［3］。

1.2.2 滅活效果測定：RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%牛血清)中加入PHA，將配好的培養(yǎng)基加入PBMC細(xì)胞中，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日用PBS洗細(xì)胞1次。細(xì)胞中加入RPMI 1640培養(yǎng)液(含 IL-20 U/mL)，放CO2培養(yǎng)箱。4 d后接種滅活的 HIV病毒。接種病毒后觀察 2 周，4、6、9、12、14 d 取樣品上清作病毒載量測定。

1.2.3 濃縮及洗滌滅活病毒：將滅活的 HIV病毒已超速離心的方法濃縮洗滌，100 000 g(29 300 rpm)4℃離心2 h。離心3次洗滌 HIV滅活病毒。

1.2.4 純化滅活 HIV病毒：XK16/70(140 mL，70 cm柱長度凝膠層)，應(yīng)用這種分子篩對(duì)滅活HIV病毒進(jìn)行純化。聚丙烯酰胺葡聚糖超微凝膠(Sephacryl S-1000 Super fine)裝填于XK16/70的柱子中并用PBS平衡柱子，調(diào)基線使基線為零。上藍(lán)色葡聚糖-2000(大分子量分子全排阻)，觀察裝柱情況，如藍(lán)色葡聚糖均勻穩(wěn)定成一條基線向下移動(dòng)證明柱子已裝好。用PBS將葡聚糖沖出。上樣，加5 ml的滅活HIV病毒進(jìn)入柱子，并用液相色譜儀記錄，收集峰值的液體，同時(shí)用 PBS洗脫。同時(shí)測定回收液280 nm的A值，確定回收的溶液中的總蛋白含量。

1.2.5 AT-2殘余量測定：氣相色譜分析：用移液器精密量取對(duì)照品100 μL，置于10 mL容量瓶中，加入乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，作為1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為 10 μg/mL，再用逐步稀釋法，配成 8、6、5、4、2、1 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積與濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用“金羊工作站”提供的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.6 殘余牛血清測定：應(yīng)用ELISA的方法檢測滅活HIV病毒中牛血清含量，根據(jù)藥典第三部要求作為抗原刺激劑的生物制品牛血清殘留量不超過50 ng/mL。

1.2.7 抗原含量測定：用ELISA方法進(jìn)行P24測定。

2 結(jié)果

2.1 HIV病毒滅活效果

AT-2滅活后的HIV-1病毒和未滅活的 HIV-1病毒分別加入到PBMC細(xì)胞中，在接種后的第4、6、9、12、14天取出一半的溶液作病毒載量測定。測定結(jié)果顯示，滅活的病毒在PBMC細(xì)胞中沒有增殖，證明病毒已經(jīng)被徹底滅活。結(jié)果見圖1。

圖1 病毒載量變化，AT-2：AT-2滅活的Note： AT-2： AT-2 inactivated HIV-1 virus;HIV-1：HIV-1 virus controlFig.1 Viral loading in days

2.2 滅活病毒濃縮及洗滌的效果

滅活的HIV-1病毒超速離心，后經(jīng)過3遍洗滌體積濃縮了100倍。RT-PCR檢測滅活HIV-1病毒載量，滅活病毒比超離前濃縮了50倍，回收率在51%左右。氣相色譜分析的方法檢測MT-2在滅活HIV-1病毒中的殘余量，AT-2殘留量在氣象色譜檢測的域值以下，即檢測不到滅活劑的殘留。滅活病毒洗滌前、后的變化見表1。

表1 滅活病毒洗滌前后比較Tab.1 Results of ultracentifugation of the inactived HIV-1 virus

2.3 對(duì)純化前、后的樣品進(jìn)行蛋白含量測定

A280nm測定峰1回收液中蛋白含量為：0.022 mg/mL;峰2回收液中蛋白含量為：0.001 mg/mL。根據(jù)液相色譜分析圖顯示圖2，兩個(gè)峰已經(jīng)完全分開，根據(jù)蛋白量計(jì)算純度為95.6%。

2.4 抗原回收率及純化結(jié)果

對(duì)幾次純化結(jié)果進(jìn)行了滅活病毒P24測定，各次結(jié)果都很接近，重復(fù)性較好。按滅活病毒原液量、純化后的滅活病毒收液量及其P24濃度進(jìn)行計(jì)算，滅活病毒的平均回收率為74%。柱層析后牛血清蛋白清除率為99%以上，純化后的樣品中牛血清蛋白殘留含量＜50 ng/mL。滅活病毒純化蛋白含量及回收率結(jié)果見表2。

圖2 滅活HIV Sephacry S-1000柱層析圖譜Fig.2 Sephacry S-1000 column chromatographic profile of the purified inactived HIV virus.

表2 滅活病毒純化蛋白含量及回收率Tab.2 Results of ultracentifugation of the inactived HIV-1 virus

3 討論

一些被滅活的完整病毒顆粒已成功應(yīng)用于疫苗研制，但以前的滅活方法可使病毒蛋白變性，免疫原性降低使滅活的病毒失去了作為免疫刺激劑的基本結(jié)構(gòu)。一接種疫苗后，值得注意的是，一些疫苗促進(jìn)了疾病的發(fā)展而非起到保護(hù)作用。我們用化合物 2，2’-dithiodipyridine(aldrithiol-2;AT-2)共價(jià)修飾人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核衣殼(NC)蛋白中的鋅指結(jié)構(gòu)［4，7］，從而滅活其感染性。滅活病毒在體外不易發(fā)覺感染性。和常規(guī)方法加熱或甲醛液處理滅活的病毒相比，保持了病毒表面的病毒和宿主細(xì)胞來源的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的完整性。AT-2滅活病毒其結(jié)構(gòu)和功能的完整性的維持表明這種病毒可能是有效的疫苗抗原［3，5-9］。我們的研究也證實(shí)了這種化學(xué)方法滅活的的病毒是被徹底滅活的，病毒不再具有感染性和復(fù)制能力。

滅活的HIV-1病毒用作體內(nèi)試驗(yàn)的免疫刺激劑，對(duì)于其純度有一定要求。其中混在的在蛋白在一定程度上會(huì)影響滅活病毒的免疫效果?；谶@種要求，對(duì)于滅活的病毒做了純化和濃縮的處理。滅活HIV病毒經(jīng)過超速離心濃縮后過Sephacry S-1000凝膠柱純化，99%以上的雜蛋白及殘留牛血清被除去。滅活病毒回收率為74%左右?？偟鞍缀康臏p少說明純度的提高，達(dá)到了純化的目的。凝膠過濾層析是層析技術(shù)中最簡單、條件最溫和，對(duì)保持生物大分子的活性最有力的方法。純化后的滅活病毒純度在95.6%，已經(jīng)可以滿足體內(nèi)試驗(yàn)的要求，為做HIV-1病毒免疫機(jī)制研究以及研發(fā)疫苗做準(zhǔn)備。

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AT-2-Inactivation of HIV-1 Virus and Its Purification and Identification

BAO Lin-lin1，DENG Wei1，SUN Li-hua1，GAO Hong1，Louis LU2，QIN Chuan1
(1.Center of Comparative Medicine，Institute of Laboratory Animal Science，CAMS＆ PUMC，Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health，Beijing 100021，China，2.Institut de Recherche sur les Vaccins et l’Immunotherapie des Cancers et Sida，Universite Rene Descartes(Paris V)，Paris，F(xiàn)rance)

Objective To prepare an inactivated HIV-1 virus with configurational integrity and more than 90%purity for HIV vaccine research.Methods HIV-1 virus was inactivated by 2，2’-dithiodipyridine(aldrithiol-2，AT-2)with complete immunogenicity.Ultracentrifugation and washing was conducted to remove the chemical reagent used for virus inactivation.The residual impurity proteins in the inactivated virus was removed by molecular sieve technology.Results For chemical inactivation，HIV-1 virus was treated with 250 μM AT-2 for 1 h at 37℃ .Chemically inactivated noninfectious SIV with conformationally and functionally intact envelope glycoproteins was produced by treatment with AT-2 as described elsewhere［1-2］.No AT-2 residue was detected in the purified inactivated virus.Residual bovine serum albumin was detected less than 50 ng/mL.Conclusions In this study HIV-1 virus was successfully inactivated with AT-2 and reached a purity of 95.6%.It can meet the requirements as an immune stimulating agent in HIV vaccine research.

AT-2;Inactivation，virus;Liquid chromatography;Purification

R33

A

1671-7856(2011)04-0021-03

2010-09-29

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.005

科技重大專項(xiàng)-艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治：2009ZX10004-307;衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目：200802036;中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)：DWS200810。

鮑琳琳，助理研究員，研究方向：艾滋病免疫治療。

秦川，教授，博士生導(dǎo)師，Email：chuanqin@vip.sina.com。