張秋勝，徐丙蓮，劉林德，程顯好，高興喜，史亞麗

(1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025； 2.魯東大學(xué)數(shù)學(xué)與信息學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；3.魯東大學(xué)體育學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025)

中國(guó)金頂側(cè)耳菌株遺傳多態(tài)性的ISSR分析

張秋勝1，徐丙蓮2，劉林德1，程顯好1，高興喜1，史亞麗3

(1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025； 2.魯東大學(xué)數(shù)學(xué)與信息學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；3.魯東大學(xué)體育學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025)

金頂側(cè)耳是重要的食藥用真菌。本實(shí)驗(yàn)收集全國(guó)各地18種金頂側(cè)耳菌株，通過(guò)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析金頂側(cè)耳菌株種內(nèi)遺傳多態(tài)性，11種引物擴(kuò)增出102個(gè)條帶，其中78個(gè)條帶具有多態(tài)性，多態(tài)率為76.4%。結(jié)果表明，金頂側(cè)耳菌株內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性，遺傳相似系數(shù)在0.50～0.96。采用平均分類(lèi)法UPGMA分析表明，在遺傳相似系數(shù)為0.62時(shí)，18種菌株分為兩大類(lèi)。當(dāng)遺傳相似系數(shù)增大到0.75時(shí)，它們分為7類(lèi)。16號(hào)菌株具有獨(dú)立的遺傳體系。

金頂側(cè)耳；簡(jiǎn)短重復(fù)序列；多態(tài)性；親緣關(guān)系

金頂側(cè)耳(Pleurotus cituinopileatus)子實(shí)體顏色淺黃或金黃，所以也叫榆黃菇，是著名的食藥用真菌[1-2]。近年來(lái)，中國(guó)金頂側(cè)耳的遺傳規(guī)律、栽培技術(shù)等已取得了一定進(jìn)展，但其種質(zhì)資源概況和遺傳基礎(chǔ)仍缺乏系統(tǒng)的研究，以致中國(guó)金頂側(cè)耳育種對(duì)種質(zhì)資源的利用存在較大的盲目性、重復(fù)性，影響了育種效率的提高[3-5]。ISSR(inter-simple sequence repeats)分子標(biāo)記是基于真核生物基因組中廣泛分布的微衛(wèi)星重復(fù)序列具有較高的重復(fù)性和穩(wěn)定性的特點(diǎn)，目前已廣泛用于遺傳多樣性、品種鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化等研究中[6-9]。

本實(shí)驗(yàn)從國(guó)內(nèi)多家菌種單位收集不同品種的金頂側(cè)耳種質(zhì)材料，應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記對(duì)中國(guó)有代表性的18種金頂側(cè)耳種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，旨在為金頂側(cè)耳的菌株鑒定、育種的親本選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株材料

收集全國(guó)各地的金頂側(cè)耳菌株，接種到PDA固體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)5～7d直到菌絲體生長(zhǎng)良好，用作本實(shí)驗(yàn)菌種。18種菌株分別編號(hào)為1～18。各實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)源如表1。

表1 金頂側(cè)耳供試菌株Table 1 Pleurotus cituinopileatus strains tested in this study

1.2 試劑與培養(yǎng)基

葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、VB1、瓊脂粉均為國(guó)產(chǎn)分析純 上海國(guó)藥集團(tuán)；Premix Taq version 2.0大連寶生物工程有限公司。

PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200g、葡萄糖20g、蛋白胨2g、KH2PO43g、MgSO41.5g、VB120mg、瓊脂17g、水1000mL，pH值自然。

1.3 儀器與設(shè)備

GIS-2020D 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng) 寧波新芝生物科技股份有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱、YXQLS-60SⅡ型全自動(dòng)數(shù)顯高壓蒸汽滅菌器 上海精密儀器儀表有限公司；PT-200型PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)PE公司。

1.4 菌株基因組總DNA抽提

經(jīng)活化的菌株在PDA液體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)7d，從培養(yǎng)基中收集菌絲球。采用CTAB法提取基因組DNA[10]。

1.5 引物

表2 實(shí)驗(yàn)引物及其序列Table 2 Primers used in this study and their sequences

隨機(jī)引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，從30條隨機(jī)引物中剔除無(wú)擴(kuò)增引物和帶紋模糊難于分辨的引物，利用擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)的11條引物擴(kuò)增不同株系的DNA樣本，以檢測(cè)引物在群體中的多態(tài)性。

1.6 ISSR分析的PCR反應(yīng)體系和程序

PCR反應(yīng)體系：Taq酶0.5U，Mg2＋2.5mmo1/L，dNTP 0.2mmo1/L，Primer 0.75μmo1/L，模板DNA 50ng。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性4min；94℃變性45s，50～52℃退火45s，72℃延伸90s，循環(huán)35次；72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.6%瓊脂糖凝膠，在不超過(guò)5V/cm的電壓下電泳，電極緩沖液為1×Tris-乙酸(TAE)，用0.5g/mL嗅化乙錠(EB)染色30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

從初選后的各組中，隨機(jī)抽取1份材料作為代表，參加不同基因型間多態(tài)性分析。統(tǒng)計(jì)各基因型間表現(xiàn)多態(tài)性好的引物的擴(kuò)增位點(diǎn)。在條帶圖上，以“0”和“1”的方式記錄電泳結(jié)果圖版中條帶位置，有條帶賦值“l(fā)”，無(wú)條帶賦值“0”，作0/1矩陣輸入計(jì)算機(jī)，采用生物學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件NTSYSPc2.10e進(jìn)行分析。運(yùn)用指數(shù)法，計(jì)算菌株間遺傳相似系數(shù)(GS)。依據(jù)遺傳距離，采用UPGMA聚類(lèi)分析構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金頂側(cè)耳菌株ISSR結(jié)果分析

從30條ISSR隨機(jī)引物中共篩選出擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定的11條較為理想的隨機(jī)引物，分別為引物826、835、834、P3、P7、P8、P12、827、812、IS5、825。由擴(kuò)增的DNA指紋圖譜(圖1、2)可以看出，每個(gè)引物對(duì)不同菌株擴(kuò)增的DNA條帶數(shù)不等，一般在5～14個(gè)之間，絕大多數(shù)擴(kuò)增片段大小在200～2200bp之間。同時(shí)，有的引物擴(kuò)增出的幾個(gè)產(chǎn)物片段為所有菌株所共有，即說(shuō)明這些引物與金頂側(cè)耳菌株DNA結(jié)合位點(diǎn)比較保守，該區(qū)域即為金頂側(cè)耳菌株物種特征遺傳信息。

圖1 引物835對(duì)18種金頂側(cè)耳菌株基因組ISSR指紋圖譜Fig.1 PCR identification of Pleurotus cituinopileatus with primer 835

圖2 引物P3對(duì)18種榆黃菇基因組ISSR指紋圖譜Fig.2 PCR identification of Pleurotus cituinopileatus with primer P3

2.2 供試菌株的ISSR多態(tài)性位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

表3 供試菌株的ISSR多態(tài)性位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Polymorphic loci amplified by ISSR of tested strains

由表3可見(jiàn)，不同引物的多態(tài)性位點(diǎn)頻率不同。引物P3的多態(tài)性位點(diǎn)頻率為55.6%，而引物812和826的多態(tài)性位點(diǎn)頻率則達(dá)87.5%，平均多態(tài)性為76.4%。另外，在11個(gè)隨機(jī)引物擴(kuò)增得到的總共102個(gè)ISSR位點(diǎn)中，有78個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，其多態(tài)性位點(diǎn)頻率為76.4%，說(shuō)明金頂側(cè)耳菌株種內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性。2.3 金頂側(cè)耳菌株間親緣關(guān)系分析

供試的18種金頂側(cè)耳菌株兩兩之間的遺傳相似系數(shù)為0.50～0.96。其中，菌株2與3號(hào)、菌株3與5號(hào)間相似系數(shù)最大(0.96)，菌株8與17號(hào)間相似系數(shù)最小(0.50)。表4是利用NTSYC-pc 2.10e 軟件分析得出的菌株間相似系數(shù)。

根據(jù)ISSR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)遺傳距離值，按UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，建立系統(tǒng)親緣關(guān)系圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 18種金頂側(cè)耳菌株的親緣關(guān)系聚類(lèi)圖Fig.3 Genetic relationship dendrogram of 18 Pleurotus cituinopileatus strains

從圖3可知，相似系數(shù)為0.62時(shí)，金頂側(cè)耳菌株主要分為兩大類(lèi)。6、7號(hào)和16號(hào)菌株組成一類(lèi)，其余的為一大類(lèi)，在這一大類(lèi)中，又可分成三類(lèi)。當(dāng)相似系數(shù)增大到0.75時(shí)，它們又可分為七類(lèi)。3、5號(hào)菌株之間親緣關(guān)系較近，相似系數(shù)為0.96，而1、6、8號(hào)菌株與16號(hào)菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相似系數(shù)只有0.54，說(shuō)明我國(guó)金頂側(cè)耳菌株資源遺傳多態(tài)性豐富。從菌株的來(lái)源看，來(lái)自盤(pán)錦新北方食用菌研究所菌種保藏中心的菌株16號(hào)和其他的各種金頂側(cè)耳親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，卻和來(lái)自江蘇省高郵市科學(xué)院的菌株9、10號(hào)親緣關(guān)系更近些，這可能與我國(guó)不同單位之間頻繁引種有關(guān)。相同或相近地區(qū)來(lái)源的菌株基本可以歸在一起，這可能與金頂側(cè)耳實(shí)際地理分布相關(guān)，如菌株14和15號(hào)；菌株4和11號(hào)均歸為一類(lèi)；同時(shí)，從菌株組成看，來(lái)自中國(guó)北方的占多數(shù)。來(lái)源相同的菌株，其遺傳結(jié)構(gòu)也不同，如菌株1和2號(hào)，這可能與其各自的繁育系統(tǒng)等因素有關(guān)。

表4 18種金頂側(cè)耳菌株間相似系數(shù)Table 4 Similarity coefficients among 18 Pleurotus cituinopileatus strains

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)是以子實(shí)體形態(tài)、菌蓋顏色、孢子的形狀及菌柄的有無(wú)等特征為分類(lèi)依據(jù)。但其形態(tài)學(xué)特征易受到環(huán)境因子的影響變得不易區(qū)分[11]。分子標(biāo)記，尤其是遺傳物質(zhì)DNA具有較高的穩(wěn)定性[12]。簡(jiǎn)單重復(fù)間序列(ISSR)標(biāo)記具有較強(qiáng)的專(zhuān)一性、重復(fù)性和可操作性。該標(biāo)記技術(shù)在靈芝、香菇等其他食用菌中已有應(yīng)用，但在金頂側(cè)耳中則未見(jiàn)報(bào)道[13-14]。

利用ISSR技術(shù)在分子水平上對(duì)我國(guó)不同來(lái)源地的金頂側(cè)耳菌株遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，中國(guó)栽培金頂側(cè)耳菌株的多態(tài)性較為豐富，可以利用和開(kāi)發(fā)的菌種資源較多。從收集菌株來(lái)源來(lái)看，北方地區(qū)總的菌株數(shù)量要大于南方地區(qū)的菌株數(shù)量，這可能與金頂側(cè)耳的主要栽培地區(qū)在中國(guó)北方相關(guān)。金頂側(cè)耳經(jīng)多年栽培，許多品種已發(fā)生了較大變異，這也可能與金頂側(cè)耳易發(fā)生變異相關(guān)[15]?？偟膩?lái)說(shuō)，金頂側(cè)耳菌株資源在我國(guó)是很豐富的，尤其是在中國(guó)北方地區(qū)。從聚類(lèi)的結(jié)果看，地域性較強(qiáng)，大部分來(lái)自同一地區(qū)的栽培菌株往往能夠聚為一類(lèi)，也有一些栽培菌株和其他地區(qū)栽培菌株聚為一類(lèi)，可能與我國(guó)金頂側(cè)耳栽培菌株引種頻繁、穿插引種等現(xiàn)象密切相關(guān)。這種現(xiàn)象在別的食用菌中也存在[16-17]。由于本研究選用了生產(chǎn)中常用18個(gè)菌株，該結(jié)果對(duì)金頂側(cè)耳系統(tǒng)學(xué)研究可提供一些參考。

親緣關(guān)系比較接近的種可能具有相同的遺傳背景，因此通過(guò)對(duì)這些菌株間親緣關(guān)系的了解，進(jìn)而可利用系統(tǒng)進(jìn)化理論做出更為合理的分類(lèi)和命名，還有利于篩選出適合雜交的品種，可以更有效地對(duì)金頂側(cè)耳進(jìn)行遺傳育種和菌株保藏。本實(shí)驗(yàn)中菌株16號(hào)離遺傳中心較遠(yuǎn)，其遠(yuǎn)緣優(yōu)勢(shì)應(yīng)在育種選育中應(yīng)引起重視。

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Genetic Polymorphism Analysis of Pleurotus cituinopileatus by ISSR

ZHANG Qiu-sheng1，XU Bing-lian2，LIU Lin-de1，CHENG Xian-hao1，GAO Xing-xi1，SHI Ya-li3
(1. School of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China；2. School of Mathmatics and Information, Ludong University, Yantai 264025, China；3. Sports Institute, Ludong University, Yantai 264025, China)

Pleurotus cituinopileatus is an important kind of edible medicinal fungi. Totally 18 kinds of Pleurotus cituinopileatus strains were collected from some markets in China. Inter-simple sequence repeat (ISSR) method was used to analyze genetic polymorphism of Pleurotus cituinopileatus strains. A total of 102 DNA fragments were amplified by using eleven ISSR primers,and 78 of these fragments were polymorphic with polymorphism rate of 76.4%. Meanwhile, high-level genetic polymorphism was observed in Pleurotus cituinopileatus and the genetic similarity coefficients (GSC) were between 0.50 and 0.96. These 18 strains were divided into 2 groups at GSC of 0.62 and 7 groups at GSC of 0.75 according to the cluster analysis of UPGMA method. Strain 16 had an independent genetic system. These results will provide a scientific fundament to accelerate genetic breeding and identification of cultivated strains of Pleurotus cituinopileatus.

Pleurotus cituinopileatus；inter-simple sequence repeat (ISSR)；polymorphism；intra-specific relationship

S646

A

1002-6630(2011)05-0172-04

2010-05-16

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BADA1B04)；魯東大學(xué)人才基金項(xiàng)目(LY20063303)；

魯東大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目；魯東大學(xué)學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目

張秋勝(1974—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)榫镞z傳學(xué)。E-mail：qiushengzhang@126.com