許旭旭，毛 政，吳 斌，孫洪林，何冰芳

（1南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；2浙江省食品藥物監(jiān)督管理局培訓(xùn)中心，浙江 杭州 310012）

研究開(kāi)發(fā)

高速逆流色譜法分離純化內(nèi)嗎啡肽-1

許旭旭1，毛 政2，吳 斌1，孫洪林1，何冰芳1

（1南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；2浙江省食品藥物監(jiān)督管理局培訓(xùn)中心，浙江 杭州 310012）

利用高速逆流色譜技術(shù)對(duì)化學(xué)酶法合成的內(nèi)嗎啡肽-1粗樣進(jìn)行分離。分析了內(nèi)嗎啡肽-1粗樣雜質(zhì)的分配系數(shù)，選擇乙酸乙酯-甲醇-水（3∶1.5∶3，體積比）作為兩相溶劑系統(tǒng)，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，在主機(jī)轉(zhuǎn)速為900 r/min，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm條件下分離制備。從120 mg粗樣中分離得到71 mg樣品，內(nèi)嗎啡肽-1的純度達(dá)99.1%，樣品回收率為91.5%。該方法簡(jiǎn)便、快速，為高純度內(nèi)嗎啡肽-1少量制法提供了技術(shù)，并可為高速逆流分離小肽合成產(chǎn)物提供指導(dǎo)。

高速逆流色譜；分離純化；內(nèi)嗎啡肽-1

內(nèi)嗎啡肽-1（EM-1：Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）是1997年由美國(guó)杜蘭大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)家James Zadina從牛腦和人腦中分離得到的四肽[1]。內(nèi)嗎啡肽-1在神經(jīng)系統(tǒng)中作用于μ-阿片受體，具有嗎啡類物質(zhì)的鎮(zhèn)痛作用，而嗎啡樣的生理依賴性、呼吸抑制及嚴(yán)重的腸胃反應(yīng)等副作用低，具有很好的研發(fā)前景[2]。目前內(nèi)嗎啡肽-1可以由化學(xué)[3]或化學(xué)酶法[4]合成，其合成產(chǎn)物的分離純化多采用傳統(tǒng)的硅膠色譜法，這種方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力、樣品損耗大，而且分離得到的產(chǎn)物純度也較低[5]。例如內(nèi)嗎啡肽-1化學(xué)合成后的分離純度一般為90%[5]，小肽也有通過(guò)制備型HPLC進(jìn)行分離的，但每次處理量較小，而溶劑消耗較大[6]。未見(jiàn)有采用高速逆流色譜法分離純化小肽合成產(chǎn)物的報(bào)道。

高速逆流色譜法（high-speed counter-current chromatography，HSCCC）是利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的不同而進(jìn)行分離的方法[7]。該技術(shù)可以用于短時(shí)間內(nèi)復(fù)雜樣品的有效分離，完全消除了因固體載體帶來(lái)的樣品不可逆的吸附和對(duì)樣品沾染等影響。目前HSCCC大多應(yīng)用于中草藥有效成分[8-9]、抗生素[10]、蛋白質(zhì)[11]等天然產(chǎn)物的分離與純化，在小肽的分離提純上報(bào)道很少。本研究首次利用高速逆流色譜法分離純化合成樣品中的內(nèi)嗎啡肽，在分析小肽化學(xué)酶法合成產(chǎn)物復(fù)雜組分的基礎(chǔ)上，選擇并優(yōu)化了高速逆流色譜分離小肽化合物的工藝，一步高回收率地得到純度為99.1%的內(nèi)嗎啡肽-1。

圖1 內(nèi)嗎啡肽-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高速逆流色譜：TBE-300B 型高速逆流色譜儀（管徑2.6 mm，柱體積300 mL，進(jìn)樣圈體積20 mL，上海同田生物技術(shù)有限公司），包括TBP-5002型恒流泵，N2000雙通道色譜工作站；HD-4型紫外檢測(cè)器（南京大學(xué)普陽(yáng)科學(xué)儀器研究所）；HX-1050型恒溫循環(huán)器（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；P680型高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司），分析柱為Kromasil 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，Kromasil，瑞典）；Water Q-TOF MicroTM質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）。

內(nèi)嗎啡肽-1標(biāo)樣（上海吉爾生化公司），色譜純甲醇（江蘇漢邦有限公司），分析純乙酸乙酯（上海申博化工有限公司，分析純氯仿（上海凌風(fēng)化學(xué)試劑有限公司），分析純正丁醇（上海申博化工有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化學(xué)酶法合成內(nèi)嗎啡肽-1

內(nèi)嗎啡肽-1酶法合成簡(jiǎn)要步驟[12]：首先采用混合酸酐法由 Boc-Tyr和 Pro-OMe合成二肽Boc-Tyr-Pro-OH；其次，在20%甲醇反應(yīng)體系中利用耐有機(jī)溶劑蛋白酶 WQ9-2催化 Boc-Trp和Phe-NH2合成二肽Boc-Trp-Phe-NH2，產(chǎn)物以晶體的形式直接從反應(yīng)體系中析出；用50%（體積比，下同）三氟乙酸去除Boc保護(hù)基團(tuán)，得到Trp-Phe-NH2；最后采用耐有機(jī)溶劑蛋白酶 PT121在水-乙酸乙酯（1∶3）雙相體系中催化 Boc-Tyr-Pro-OH 和Trp-Phe-NH2縮合制備Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2；用同樣的方法去除 Boc保護(hù)基后得到內(nèi)嗎啡肽-1（Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2）混合酶，為含 64.1%內(nèi)嗎啡肽-1的粗品。

1.2.2 溶劑體系的選擇

按溶劑體系配制一定體積的上相、下相溶劑，各取相同體積的上相、下相溶劑放置于同一容器中，加入一定量的樣品，劇烈振搖后靜置，待上相與下相分層后，取相同體積的上相和下相樣品液，然后用液相色譜以測(cè)定目標(biāo)成分在上相和下相中的濃度Cu、Cl，用來(lái)計(jì)算分配系數(shù)K（K=Cu/Cl）。

1.2.3 分離方法

在分液漏斗中配制經(jīng)過(guò)篩選的最佳溶劑，混合后靜置過(guò)夜，取上相作為高速逆流色譜的固定相，取下相作為流動(dòng)相，超聲波脫氣30 min處理后，用20 mL固定相溶解120 mg樣品。高速逆流色譜體系開(kāi)機(jī)預(yù)熱后，先將固定相以10 mL/min 的恒定速度泵滿螺旋管柱（200 mL），緩慢調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速至900 r/min順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，同時(shí)以2.0 mL/min 泵入流動(dòng)相，待流動(dòng)相開(kāi)始流出分離柱時(shí)，從進(jìn)樣口進(jìn)樣，流速改為1.0 mL/min，同時(shí)開(kāi)啟檢測(cè)器，以280 nm 波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)色譜圖收集流出液體。

1.2.4 純度分析和質(zhì)譜檢測(cè)

使用HPLC對(duì)制備得到的樣品進(jìn)行純度分析，根據(jù)何平等[4]報(bào)道的方法略作調(diào)整，所用色譜柱為上述Kromasil 100-5 C18柱，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量為10 μL。流動(dòng)相為甲醇和水，梯度洗脫程序：0～5 min，20%甲醇；5～30 min，20%～100% 甲醇；30～40 min，100% 甲醇；流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜儀在正離子模式下采集數(shù)據(jù)，離子源參數(shù) ESI：毛細(xì)管電壓2500 V，樣品錐電壓30 V，脫溶劑室溫度100 ℃，離子源溫度200 ℃，霧化氣（N2）體積流量50 L/h，脫溶劑氣（N2）體積流量400 L/h。

樣品的核磁檢測(cè)由中國(guó)藥科大學(xué)完成。

2 結(jié)果和討論

2.1 HSCCC分離體系的選擇

溶劑體系的選擇對(duì)分離效果起著決定性作用，不同的溶劑系統(tǒng)具有黏度、極性、密度等性質(zhì)的差異，均會(huì)對(duì)相同的成分產(chǎn)生不同的溶解、分配能力，形成分配系數(shù)的差異，合適的體系應(yīng)該具有比較理想的分配系數(shù)，K值在0.5～2.0之間最佳，不同樣品的分配系數(shù)差值大于0.5可以得到有效分離[13]。本研究首先分析樣品中的主要成分，經(jīng)過(guò)二肽酶法縮合并去除Boc保護(hù)的樣品經(jīng)過(guò)HPLC檢測(cè)，共有7個(gè)峰[見(jiàn)圖3（b）]，其中峰2是極性相近的底物——二肽Trp-Phe-NH2，峰3是目標(biāo)化合物內(nèi)嗎啡肽-1（Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2），峰 5為另一底物Boc-Tyr-Pro-OH，峰 6為脫保護(hù)前的內(nèi)嗎啡肽-1（Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2），峰1、峰4、峰7是酸解過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)。本研究選擇了幾種不同極性的體系并在較好體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行了微調(diào)，通過(guò)考察不同體系的分配系數(shù)K值，來(lái)選擇合適的溶劑體系。由表1可知，在溶劑氯仿∶甲醇∶水（4∶3∶2，體積比，下同）中雜質(zhì)1、2與3的K值相近，不能很好的分離；在溶劑正丁醇∶乙酸乙酯∶水（體積比5∶1∶6）中雜質(zhì)4、5、6分配系數(shù)比較大，會(huì)導(dǎo)致較長(zhǎng)的分離時(shí)間和較寬的峰形，不適合內(nèi)嗎啡肽-1的分離純化；在溶劑乙酸乙酯/甲醇/水體系中隨著甲醇比例的適當(dāng)增加，內(nèi)嗎啡肽-1（3）的分配系數(shù)達(dá)到了合適的范圍，同時(shí)與雜質(zhì)的K值差異也較大，保證與雜質(zhì)有較好的分離度。在乙酸乙酯∶甲醇∶水（體積比 3∶1.5∶3，）體系中不僅目標(biāo)產(chǎn)物內(nèi)嗎啡肽-1有合適的分配系數(shù)0.7，且與其它組分1、2、4、5、6、7的K值差異大于0.5，故將其選擇為分離小肽合成粗品中的內(nèi)嗎啡肽-1的溶劑體系。

表1 不同溶劑體系下粗樣的分配系數(shù)

2.2 內(nèi)嗎啡肽-1的HSCCC分離結(jié)果

利用選擇的溶劑體系，按照 1.2.3節(jié)的方法對(duì)內(nèi)嗎啡肽-1粗樣進(jìn)行HSCCC分離，固定相保留率45.0%，分離時(shí)間為2.5 h，根據(jù)圖譜（見(jiàn)圖2）收集餾分A（內(nèi)嗎啡肽-1）。陰影部分為餾分收集區(qū)間，對(duì)組分A進(jìn)行減壓濃縮，得到白色粉末71 mg（進(jìn)樣量為120 mg，粗品純度64.1%），收率為91.5%。

圖2 內(nèi)嗎啡肽-1合成粗樣品的HSCCC 色譜圖

2.3 產(chǎn)物的純度檢測(cè)和鑒定

將收集到的A峰與內(nèi)嗎啡肽-1標(biāo)樣進(jìn)行HPLC檢測(cè)，從HPLC 色譜圖中可以看出，在280 nm波長(zhǎng)條件下，餾分A 僅有一個(gè)色譜峰出現(xiàn)且保留時(shí)間與內(nèi)嗎啡肽-1標(biāo)樣相同（見(jiàn)圖3），同時(shí)采用HPLC峰面積歸一化法，計(jì)算分離得到的餾分A 的純度為99.1%，回收率為91.5%，與傳統(tǒng)的小肽分離方法相比效果顯著。如Giuliana等[14]采用硅膠柱分離內(nèi)嗎啡肽-1的類似物，回收率只有 60%～90%，Wang等[15]采用硅膠柱層析法分離內(nèi)嗎啡肽-2的類似物回收率為40%～90%。

圖3 內(nèi)嗎啡肽-1的HPLC色譜圖

對(duì)餾分 A作高分辨質(zhì)譜檢測(cè)，HRMS：m/z611.2994. Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2（C34H39N6O5）[M+H]+的理論計(jì)算值為611.2982，在儀器誤差范圍內(nèi)與內(nèi)嗎啡肽-1的相對(duì)分子質(zhì)量一致；對(duì)分離所得的內(nèi)嗎啡肽-1進(jìn)行核磁分析（核磁共振結(jié)果由中國(guó)藥科大學(xué)提供）：1HNMR（DMSO，500 MHz）：δ10.79（trans）和 10.74（cis）（s，s，1H，W1NH），9.43（cis）和9.35（trans）（s，s，1H，YOH），8.22（d，8.3，1H，WNH），8.03，7.85（dd，8.1，2H，YNH2），7.99（d，7.5，1H，F(xiàn)NH），7.59～7.56（m，trans+cis，1H，W2ar），6.90～7.33（m，14H，aromatic），6.70～6.67（m，trans+cis，2H，Y3，5），4.39～4.51（m，3H，PαWαFα），4.18（t，6.0，1H，Yα），2.77～3.09（m，8H，Yβ1Yβ2Fβ1Fβ2Wβ1Wβ2Pδ1Pδ2），1.50～1.96（m，4H，Pβ1Pβ1Pg1Pg2）。13C NMR（DMSO，500M Hz，trans+cis）δ172.6、172.5、170.9、170.8、170.7、170.3、167.0、156.7、156.5、137.7、136.0、130.7、130.3、129.2、127.9、127.3、127.2、126.2、124.6、124.0、123.6、123.2、120.9、120.8、118.2、115.3、111.4、111.2、109.9、109.7、59.6、59.1、53.6、52.5、46.7、37.4、36.3、35.3、31.1、28.8、27.5、27.4、24.4。綜合 HPLC，質(zhì)譜及核磁共振譜的檢測(cè)結(jié)果可確定餾分A 為內(nèi)嗎啡肽-1。

3 結(jié) 論

采用高速逆流色譜首次分離了化學(xué)酶法合成二肽混合物，利用乙酸乙酯-甲醇-水（體積比為3∶1.5∶3）溶劑體系從120 mg（粗樣含量64.1%）的合成粗樣中一步分離得到71 mg純度為99.1%的內(nèi)嗎啡肽-1，回收率為 91.5%。方法簡(jiǎn)捷、快速、回收率高，為分離制備高純度的內(nèi)嗎啡肽-1提供了實(shí)用的手段，同時(shí)也為化學(xué)法或化學(xué)酶法合成肽類產(chǎn)品的高效分離純化提供指導(dǎo)。

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Preparative isolation and purification of endormophin-1 by high-speed counter-current chromatography

XU Xuxu1，MAO Zheng2，WU Bin1，SUN Honglin1，HE Bingfang1
（1College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，Jiangsu，China；2Zhejiang Food and Drug Administration Training Center，
Hangzhou 310012，Zhejiang，China）

Endormophin-1 synthesized by chem-biological method was purified by high-speed counter-current chromatograph technology（HSCCC）. The optimum separation conditions were as follows：A two-phase solvent system was ethyl acetate-methanol-water（3∶1.5∶3，v/v/v）. The lower phase as the mobile phase was operated at a flow rate of 1.0 mL /min，while the apparatus was rotated at 900 r/min，and detection were length was at 280 nm. Each time 120 mg of the crude sample was loaded under these conditions，and 71 mg of endorphin-1 with the purity of 99.1% was obtained. The recovery was 91.5%. The method was relatively simple，fast，and applicable to the large-scale isolation and separation of endormophin-1.

high-speed counter-current chromatography（HSCCC）；preparative isolation and purification ；endormophin-1

TQ 028.9+8

A

1000-6613（2011）09-2064-05

2011-03-03；修改稿日期2011-04-27。

國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（2011CB710800）。

許旭旭（1985—），男，碩士研究生。聯(lián)系人：何冰芳，博士，教授，主要從事應(yīng)用微生物、酶工程方面的研究。E-mail bingfanghe@njut.edu.cn。