易 喻，崔國艷，王 鴻，李 敏，朱克寅，應(yīng)國清

（1浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310032，2杭州博林生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310018）

研究開發(fā)

一種新型殼聚糖分離介質(zhì)的制備

易 喻1，崔國艷1，王 鴻1，李 敏1，朱克寅2，應(yīng)國清1

（1浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310032，2杭州博林生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310018）

以殼聚糖為載體、液體石蠟為分散介質(zhì)、戊二醛為交聯(lián)劑、Span80 為乳化劑，采用反相懸浮法制備殼聚糖微球，以環(huán)氧氯丙烷為活化劑、亞氨基二乙酸為螯合配基制備新型殼聚糖分離介質(zhì)，并研究分離介質(zhì)制備過程中各參數(shù)對殼聚糖分離介質(zhì)性能的影響。確定最佳活化工藝為：40% DMSO/NaOH（0.6 mol/L）、ECH體積分?jǐn)?shù)10%、反應(yīng)溫度40 ℃、反應(yīng)時(shí)間4 h，測得環(huán)氧基修飾密度可達(dá)到0.15 mmol/g（gel）；最佳螯合工藝：IDA（0.6 mol/L）/ NaOH（2.0 mol/L）混合液，反應(yīng)時(shí)間為6 h，制備的新型殼聚糖分離介質(zhì)對Cu2+吸附量達(dá)到172.787 g/g gel，殼聚糖分離介質(zhì)含水率為45.60%，孔隙率為69.45% ，得到一種新型金屬螯合層析填料。

殼聚糖；金屬螯合層析填料；環(huán)氧氯丙烷

固定化金屬螯合親和層析（immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC）是近二十年發(fā)展起來的一項(xiàng)新型分離技術(shù)。該法最早由 Porath等[1]提出，其主要是利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸，如組氨酸、色氨酸、賴氨酸等能和金屬離子發(fā)生特殊的相互作用，從而對蛋白質(zhì)加以分離。IMAC具有螯合介質(zhì)制備簡單方便、交換載量大、分離條件溫和、通用性強(qiáng)、易于放大，特別是在蛋白的純化過程中，其溫和的洗脫條件，可較好的保持蛋白的生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)，使得其應(yīng)用越來越受到重視，將成為蛋白質(zhì)純化中最具潛力的層析方法[2-3]。

開發(fā)新型性能良好、適于蛋白質(zhì)分離的固定化金屬螯合分離介質(zhì)具有重要的意義[4]。殼聚糖作為產(chǎn)量僅次于纖維素的天然高分子，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一天然堿性多糖，其分子鏈上豐富的羥基和氨基使其易于進(jìn)行化學(xué)修飾而賦予多種功能[5]，近年來由于其無毒性及較好的生物相容性和生物降解性[6]，在醫(yī)藥、食品、環(huán)保、輕工、農(nóng)業(yè)等方面獲得廣泛的應(yīng)用[7]。如將殼聚糖制備成單分散的窄分布高分子微球，使殼聚糖和高分子微球的功能相結(jié)合，使其在蛋白分離中得到更大的應(yīng)用[8]。

本文選用殼聚糖為基質(zhì)載體、戊二醛為交聯(lián)劑、環(huán)氧氯丙烷為活化劑、亞氨基二乙酸（IDA）為鰲和配基制備新型殼聚糖分離介質(zhì)，并研究了制備過程中各因素對殼聚糖介質(zhì)吸附性能的影響，從而確定出最佳的制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

殼聚糖（脫乙酰度≥95%，浙江金殼生物化學(xué)有限公司，Mw為300 kDa）、冰乙酸、NaOH、液體石蠟、環(huán)己烷、戊二醛溶液（25%，體積比）、環(huán)氧氯丙烷、亞氨基二乙酸、二甲基亞砜等，試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖介質(zhì)的制備

（1）交聯(lián) 將適量殼聚糖溶解在100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的乙酸溶液中，室溫下靜置過夜，備用。于裝有機(jī)械攪拌器及溫度計(jì)的500 mL 三口瓶內(nèi)，依次加入液體石蠟、環(huán)己烷和少許Span 80 ，攪拌0.5 h 后，加入上述殼聚糖溶液，用水浴鍋將體系加熱至55 ℃，攪拌1 h，恒壓滴液漏斗緩慢滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25% 的戊二醛；用10% NaOH 溶液調(diào)pH值至10 ，然后升溫至65 ℃，繼續(xù)反應(yīng)3 h后，趁熱用真空抽濾泵將得到的微球?yàn)V出，用蒸餾水反復(fù)水洗后，再在圓底燒瓶中加150 mL 石油醚，用索氏提取器抽提，然后用無水乙醇索氏抽提，晾干、真空干燥至恒重，制得殼聚糖微球[9-10]。

（2）活化 稱取一定量殼聚糖微球，經(jīng)水充分溶脹后，依次用20%、50%、70%的DMSO水溶液清洗；向處理后的產(chǎn)物中加入一定量的DMSO/NaOH溶液和環(huán)氧氯丙烷，振蕩反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后用大量蒸餾水沖洗，直至清洗液中無環(huán)氧基檢出。其中，殼聚糖環(huán)氧基修飾密度采用硫代硫酸鈉滴定法測定[11]。

（3）鍵合螯合配基 取 50 mL一定濃度的IDA/NaOH混合溶液加入到活化后的殼聚糖微球中，在水浴搖床中振蕩反應(yīng)一定時(shí)間，洗滌至中性，用布氏漏斗抽干，得適于蛋白質(zhì)分離的殼聚糖介質(zhì)。

（4）金屬離子螯合 取殼聚糖分離介質(zhì)裝柱（1.0 cm × 15 cm），用0.1 mol/L的CuSO4溶液灌流，分離柱螯合銅離子至飽和后用0.05 mol/L pH值7.5 Tris-HCl緩沖液清洗，可得到螯合銅離子的殼聚糖分離介質(zhì)。

1.2.2 殼聚糖分離介質(zhì)孔度值（P）的表征[12]

于比重瓶中加滿正庚烷并稱重（W1），倒出正庚烷，加入一定量干燥過的交聯(lián)殼聚糖樹脂（W），將樹脂在正庚烷中浸泡2 h后，用正庚烷加滿比重瓶并稱重（W2），則干燥過的樹脂骨架體積見式（1）。

式中，dt為測定溫度下正庚烷的密度，dt= 0.6830 g/cm3，骨架密度見式（2）。

另外稱取一定量的水溶脹后的交聯(lián)殼聚糖樹脂（盡量吸干表面水分）于烘箱中烘至恒重（G），則樹脂中水分所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為式（3）。

樹脂的孔度值可用式（4）計(jì)算。

1.2.3 環(huán)氧基修飾密度的定量分析

殼聚糖介質(zhì)的環(huán)氧基修飾密度采用硫代硫酸鈉滴定法[13]測定，經(jīng)去離子水清洗后的活化介質(zhì)用布氏漏斗抽干，隨后稱取0.5 g置于磨口錐形瓶中并加入約5 mL1.3 mol/L硫代硫酸鈉和酚酞指示劑1～2滴，錐形瓶封口后置于室溫下振蕩反應(yīng)30 min，反應(yīng)后的溶液用0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至溶液由紅色變?yōu)闊o色為止，根據(jù)消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，由式（5）計(jì)算環(huán)氧基修飾密度。

式中，S為環(huán)氧基修飾密度，mmol/g；MHCl為 HCl濃度，mol/L；V0、V1分別為滴定前、后 HCl的體積，mL；ρ為介質(zhì)密度，1.02 g/mL。

1.2.4 Cu2+螯合量的測定

稱取一定量的殼聚糖介質(zhì)，加入 10 mL 0.4 mol/L的CuSO4溶液，置于搖床中振蕩反應(yīng)一定時(shí)間，真空抽濾后利用分光光度法[14]測定濾液中Cu2+含量，即可確定Cu2+螯合量。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)參數(shù)對殼聚糖成球的影響

2.1.1 戊二醛濃度對殼聚糖微球制備的影響

當(dāng)殼聚糖在酸性條件下交聯(lián)時(shí)，會(huì)因分子中的—NH2被質(zhì)子化形成—NH3+而溶于水造成分離介質(zhì)的流失，影響其性能，也不利于再生，因此可用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，使原來無序線狀分子形成立體網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，從而提高吸附效率[15-16]。

將殼聚糖的濃度固定為 3%，液體石蠟與殼聚糖溶液的比例定為1∶1，環(huán)己烷15 mL，以不同體積的戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，其它條件不變進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖 1），交聯(lián)劑對殼聚糖的成球有重要影響。戊二醛用量增大，使得表面交聯(lián)層增厚，導(dǎo)致產(chǎn)物顏色加深，黏著嚴(yán)重，微球交聯(lián)過于致密，多孔性降低，從而使得微球的孔隙率降低，但戊二醛加量太少，殼聚糖形成的球形不好。因此，綜合考慮，當(dāng)戊二醛加量為 3 mL時(shí)，這時(shí)殼聚糖微球球形較好，測得的殼聚糖微球含水率為60.07%，孔隙率為53.92%，并且分布粒度較窄。

2.1.2 攪拌速度對微球成球性及粒度大小的影響

固定其它實(shí)驗(yàn)條件不變，改變反應(yīng)體系的攪拌速度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

高速公路隧道工程施工難度系數(shù)比較高，各種不確定情況發(fā)生的概率也比較高，高速公路隧道施工的特殊性是比較明顯的。為了切實(shí)提升高速公路隧道項(xiàng)目的施工質(zhì)量，要根據(jù)實(shí)際情況對施工方案更加優(yōu)化，同時(shí)選擇最合適的施工技術(shù)。

圖1 戊二醛對殼聚糖交聯(lián)的影響

圖2 攪拌速度對殼聚糖交聯(lián)的影響

由圖2可以看出，攪拌速度對殼聚糖成球以及顆粒大小有重要影響，攪拌過快，雖然成球粒徑分布較窄，微球孔隙率降低；攪拌過慢，成球性降低；這主要是因?yàn)楫?dāng)攪拌速度提高時(shí)，分散介質(zhì)中的殼聚糖液滴粒徑減小，液滴數(shù)目增多，比表面積增大，與交聯(lián)劑接觸面積增加，導(dǎo)致交聯(lián)致密。綜合考慮，只有當(dāng)轉(zhuǎn)速為400 r/min 時(shí)，對殼聚糖成球最有利，此時(shí)測得的殼聚糖微球孔隙率為53.47%。

2.2 殼聚糖介質(zhì)的性能測定

經(jīng)上述各條件實(shí)驗(yàn)，交聯(lián)劑用量為3 mL、攪拌速度為400 r/min時(shí)，得到產(chǎn)物的掃描電鏡圖見圖3。

圖3中，殼聚糖微球有個(gè)別出現(xiàn)凹陷現(xiàn)象，可能是在制備過程中，殼聚糖微球表面附著了極細(xì)的殼聚糖珠體，但在后續(xù)處理過程中脫落。

2.3 活化條件的確定

2.3.1 DMSO對環(huán)氧基修飾密度的影響

其它條件不變，分別加入體積分?jǐn)?shù)（φ）為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的DMSO與NaOH（1 mol/L）的混合溶液進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果見圖4。

圖3 殼聚糖微球的掃描電鏡圖（×100）

圖4 φDMSO對環(huán)氧基修飾密度的影響

由圖4可知，隨著反應(yīng)體系中DMSO含量的增大，環(huán)氧基修飾密度有所提高，當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.4后殼聚糖微球的環(huán)氧基密度趨于穩(wěn)定。這可能是由于溶劑效應(yīng)造成的。因?yàn)镈MSO能與環(huán)氧氯丙烷互溶，使整個(gè)反應(yīng)體系處于均相，從而使得環(huán)氧基密度增加。環(huán)氧氯丙烷作為一種常用的活化試劑，其在水溶液中有限的溶解度以及由此引發(fā)的其在殼聚糖微球中的低擴(kuò)散通量是引起活化時(shí)間長、活化密度低的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)通過在活化體系中引入水溶性有機(jī)試劑提高環(huán)氧氯丙烷在活化體系中的溶解度，以期強(qiáng)化環(huán)氧氯丙烷活化反應(yīng)；而DMSO不僅與水完全混溶，而且對于多種配基亦有很好的溶解性，這對獲得高配基修飾密度是至關(guān)重要的。

2.3.2 NaOH 濃度對環(huán)氧基修飾密度的影響

其它條件不變，分別加入濃度為0、0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L的NaOH與DMSO（φDMSO為0.4）的混合溶液進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，NaOH濃度對活化程度也有影響，隨著NaOH濃度增加，環(huán)氧基修飾密度先上升后降低，但在濃度為0.6 mol/L時(shí)，環(huán)氧基密度達(dá)到最大，這可能是由于堿濃度過高會(huì)導(dǎo)致殼聚糖分離介質(zhì)上的環(huán)氧基開環(huán)所致。

圖5 NaOH濃度對環(huán)氧基修飾密度的影響

2.3.3 環(huán)氧氯丙烷加量對環(huán)氧基修飾密度的影響

其它條件不變，分別加入體積分?jǐn)?shù)φECH為5%、10%、15%、20%、25%的ECH進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，隨著ECH濃度的增加，環(huán)氧基活化密度有所增加，當(dāng)其體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%之后，環(huán)氧基修飾密度趨于穩(wěn)定，這與水溶液體系中的結(jié)果是一致的[16]。

2.3.4 反應(yīng)時(shí)間對環(huán)氧基修飾密度的影響

其它條件不變，分別反應(yīng)2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，其結(jié)果見圖7。

由圖7可知，環(huán)氧基修飾密度隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而增加；在4 h以后開始有所下降，此時(shí)活化反應(yīng)基本完成，但 ECH在堿性條件下因?yàn)榘l(fā)生水解而失活，導(dǎo)致測定的環(huán)氧基有所下降。

2.3.5 反應(yīng)溫度對環(huán)氧基修飾密度的影響

其它條件不變，分別在20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果見圖8。

由圖8可知，環(huán)氧基修飾密度隨著反應(yīng)溫度的升高有明顯的降低，反應(yīng)溫度達(dá)到 40 ℃時(shí)達(dá)到最大值，可能是由于溫度升高，使得殼聚糖微球本身發(fā)生了降解。

圖6 φECH對環(huán)氧基修飾密度的影響

圖7 反應(yīng)時(shí)間對環(huán)氧基修飾密度的影響

圖8 反應(yīng)溫度對環(huán)氧基修飾密度的影響

綜合以上反應(yīng)條件可知，活化的最佳工藝為：DMSO體積分?jǐn)?shù)為0.4、NaOH濃度為0.6 mol/L、ECH體積分?jǐn)?shù)為10%、反應(yīng)4 h、反應(yīng)溫度為40 ℃，此時(shí)環(huán)氧基修飾密度可達(dá)到0.15 mmol/g。

2.4 螯合配基反應(yīng)條件的影響

2.4.1 螯合配基濃度的影響

稱取0.5 g活化好的殼聚糖微球，分別加入濃度為0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L IDA與NaOH（濃度為1.0 mol/L）的混合溶液，置于60 ℃水浴搖床中反應(yīng)4 h，洗滌、抽濾。測定Cu2+的螯合量，結(jié)果見圖9。

由圖9可知，隨著IDA濃度的增加，Cu2+吸附量逐漸增加，當(dāng)其濃度達(dá)到0.6 mol/L之后，Cu2+吸附量趨于穩(wěn)定，由此可間接反映螯合配基已達(dá)到飽和。

2.4.2 NaOH濃度對反應(yīng)的影響

稱取0.5 g活化好的殼聚糖微球，分別加入濃度為0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L、3.0 mol/L NaOH與 IDA（濃度為 1.0 mol/L）混合溶液，置于60 ℃水浴搖床中反應(yīng)4 h，洗滌、抽濾。測定Cu2+的螯合量，結(jié)果見圖10。

由圖10可以看出，隨著NaOH濃度的增加，Cu2+螯合量先增加后趨于平穩(wěn)。

圖9 IDA濃度對Cu2+螯合量的影響

圖10 NaOH濃度對Cu2+螯合量的影響

2.4.3 時(shí)間對反應(yīng)的影響

稱取0.5 g活化好的殼聚糖微球，加入濃度為0.4 mol/L IDA與濃度為1.0 mol/L NaOH混合溶液，置于60 ℃水浴搖床中分別反應(yīng)2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，洗滌、抽濾。測定Cu2+的螯合量，結(jié)果見圖11。由圖11可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，Cu2+的螯合量先增加后降低。

綜上所述，殼聚糖介質(zhì)最佳的制備工藝為：IDA濃度為0.6 mol/L，NaOH濃度為2.0 mol/L，60 ℃水浴搖床170 r/min，反應(yīng)6 h，制備的新型殼聚糖分離介質(zhì)對Cu2+吸附量達(dá)到172.787 g/g。

3 結(jié) 論

以殼聚糖為載體，環(huán)氧氯丙烷為活化劑，亞氨基二乙酸為金屬螯合配基制備新型殼聚糖分離介質(zhì)，對分離介質(zhì)的制備過程、活化過程以及螯合配基過程的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化以確定出最優(yōu)的制備工藝。

（1）采用1.0 mL/g（殼聚糖）戊二醛對殼聚糖在攪拌速度為400 r/min條件下進(jìn)行交聯(lián)，可以制得殼聚糖微球呈紅棕色，成球率可達(dá)到90%以上，球形好、分布窄的殼聚糖微球。其含水率為45.60%、孔隙率為69.45%。

圖11 反應(yīng)時(shí)間對Cu2+螯合量的影響

（2）活化工藝：通過引入親水性溶劑DMSO，可消除殼聚糖微球與環(huán)氧氯丙烷的相界面，促進(jìn)活化試劑的溶解，提高了殼聚糖微球的環(huán)氧基修飾密度。DMSO 體積分?jǐn)?shù)為 0.4、NaOH濃度為 0.6 mol/L、ECH體積分?jǐn)?shù)為10%、反應(yīng)4 h、反應(yīng)溫度為 40 ℃，此時(shí)環(huán)氧基修飾密度可達(dá)到 0.15 mmol/g。

（3）螯合工藝：IDA濃度為0.6 mol/L，NaOH濃度為2.0 mol/L，60 ℃水浴搖床170 r/min，反應(yīng)6 h，制備的新型殼聚糖分離介質(zhì)對Cu2+吸附量達(dá)到172.787 g/g。

該法制備的新型殼聚糖分離介質(zhì)可用于固定化金屬螯合層析填料。

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Study the preparation of a novel crossl-linked chitosan support

YI Yu1，CUI Guoyan1，WANG Hong1，LI Min1，ZHU Keyin2，YING Guoqing1
（1College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，Zhejiang，China；2Hangzhou Bolin Biotechnolgy Co. Ltd.，Hangzhou 310018，Zhejiang，China）

Investigation was carried out to elucidate the infuence of process parameters on the characteristics of chitosan microspheres prepared by reverse phase suspension cross-linked polymerization. The chitosan droplet solidifed and hardened by glutaraldehyde crosslinking agent was dispersed in the oil phase composed of liquid paraffin in the presence of Span 80 surfactant. Iminodiacetic acid（IDA）was attached onto chitosan microspheres activated by epichlorohydrin under basic condition. The results indicated that the optimal epoxy density above 0.15 mmol/g gel was achieved at 10%（φ）epichlorohydrin as activating accelerator in the solution consisting of 0.6 mol/L NaOH and 40% DMSO. The study on linkaging of IDA demonstrated that the support was synthesized in the solution composed of 0.6 mol/L IDA and 2.0 mol/L NaOH at 60 ℃ for 6 h，whose adsorption of Cu2+was up to 172.787 g/g gel. The moisture content of the matrix was up to 45.60% and the porosity was 69.45% under the optimized conditions. The novel matrix could be used in immobilized metal ion affinity chromatography as the solid phase.

chitosan；metal chelate affinity chromatography；epichlorohydrin

O 63

A

1000-6613（2011）09-2049-06

2011-02-25；修改稿日期2011-03-25。

浙江省科技廳項(xiàng)目（2009C33089）。

易喻（1978 —），男，講師，研究方向?yàn)樯蛛x工程及酶工程。聯(lián)系人：應(yīng)國清，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail gqying@zjut.edu.cn。