洪宗國,易 筠,王 東

(中南民族大學(xué)藥學(xué)院,武漢430074)

蘄艾總鞣酸對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用

洪宗國,易 筠＊,王 東

(中南民族大學(xué)藥學(xué)院,武漢430074)

通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生OH,連苯三酚自氧化產(chǎn)生O-2·模型,研究了蘄艾總鞣酸體外清除自由基作用.結(jié)果顯示:蘄艾總鞣酸在1.0～10.0 mg/mL范圍內(nèi)對羥自由基和超氧陰離子自由基均具有清除作用,兩者均呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系,最有效的清除濃度均為8.0mg/mL,清除自由基能力均高于同等濃度的甘露醇,但低于同等濃度的抗壞血酸.

蘄艾總鞣酸;羥自由基;超氧陰離子自由基;抗氧化

艾(A rtem isia argy iL evl et V ant)是菊科多年生草本植物,為傳統(tǒng)中藥[1,2],具有散寒止痛、溫經(jīng)止血的功效[3].近年隨著對自由基研究的深入,人體內(nèi)自由基被認(rèn)為是引發(fā)癌變,衰老和細(xì)胞損傷的重要原因,篩選出具有清除自由基能力的天然抗氧化劑已成為世界研究熱點(diǎn)[4-6].鞣酸是一種廣泛存在于植物中的多酚類物質(zhì),由于其自身所具有的多酚羥基結(jié)構(gòu)而具有較強(qiáng)的抗氧化能力.但有關(guān)蘄艾總鞣酸抗氧化能力的文獻(xiàn)尚未見報(bào)道,因此本文利用超聲法提取蘄艾中總鞣酸,并以Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基模型,以鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生超氧陰離子模型,通過紫外和可見分光光度法研究蘄艾中總鞣酸對·OH和O-2·的體外清除作用,以期探討蘄艾鞣酸體外清除自由基的能力,為其作為一類新的抗氧化劑的的應(yīng)用提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 儀器與試劑

1.1 儀器

KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);752紫外光珊分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠);HH-2恒溫水浴鍋(金壇市科興儀器廠);BT-224S電子分析天平(北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司);SHZ-3(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(河南省予華儀器有限公司).

1.2 試劑

丙酮、鹽酸、石油醚、無水乙醇、過氧化氫、甘露醇、抗壞血酸 (V c)、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、水楊酸、三(羥甲基)氨基甲烷(T ris)焦性沒食子酸 (分析純),均購自武漢化學(xué)試劑公司.艾葉采自湖北省蘄春縣,采集日期均為2008年端陽節(jié),品種鑒定由湖北省蘄春縣醫(yī)藥工業(yè)辦公室郭雙喜(工程師)完成.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蘄艾總鞣酸的提取

蘄艾中鞣酸為水溶性多酚類物質(zhì),提取工藝采用超聲波提取法[7]:稱取60 g蘄艾,置于2 L燒杯中,加丙酮-水混合溶劑(V丙酮∶V蒸餾水=4∶6)1500 mL浸泡1 h后,于超聲時(shí)間20 m in、溫度60℃,功率150W 條件下超聲提取,減壓抽濾,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃濃縮至溶液無酮味并石油醚去脂3次,水溶液部分濃縮得鞣酸浸膏,將浸膏以水溶解配置成不同濃度溶液備用.

2.2 蘄艾鞣酸對超氧陰離子自由基的清除作用

連苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng),生成超氧陰離子自由基O-2·與連苯三酚氧化中間產(chǎn)物,該中間產(chǎn)物于λ=320 nm 處有一特征吸收峰.當(dāng)加入抗氧化劑時(shí),鄰苯三酚自氧化過程受阻,O-2·的生成受到抑制,溶液在320 nm處吸收減弱,故通過測定吸光值變化可推斷樣品對O-2的清除作用[8].

取5.6 mL T ris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH值8.2),分別加入0.2 mL蘄艾總鞣酸提取液、甘露醇和抗壞血酸溶液,于25℃放置10 m in,分別加入0.2 mL預(yù)熱至25℃的鄰苯三酚(60 mmol/L),反應(yīng)4 m in后滴加10 mol/L鹽酸終止反應(yīng),以蒸餾水補(bǔ)足體積,于320 nm 處測其吸光值A(chǔ)0,空白實(shí)驗(yàn)以等量蒸餾水0.2mL代替抗氧化劑溶液,測定其吸光值A(chǔ)x.用5.6 mL T ris-HCl緩沖液、2滴10 mmol/L HCl及0.2mL抗氧化劑溶液調(diào)零點(diǎn),以扣除試樣本身顏色的影響,平行測定3次,取平均值,并通過以下公式計(jì)算各種抗氧化劑對超氧陰離子自由基的清除率(清除率S=(Ax-A0)/Ax×100%).

2.3 蘄艾鞣酸對羥基自由基的清除作用

H2O2與Fe(Ⅱ)混合后產(chǎn)生的·OH 的Fenton反應(yīng)中,·OH具有很高的反應(yīng)活性,存活時(shí)間短,在反應(yīng)體系中加入水楊酸,能有效地捕捉·OH并產(chǎn)生紫紅色產(chǎn)物.該產(chǎn)物在510 nm處有強(qiáng)吸收,若加入羥自由基清除劑,可使有色產(chǎn)物的生成量減少,采用固定反應(yīng)時(shí)間法,于510 nm處測定含被測物的溶液吸光度,并與空白組對照,即可確定提取液對羥基自由基的清除作用[9].

在10 mL容量瓶中依次加入6 mmol/L的硫酸亞鐵水溶液1 mL,6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL后,將節(jié)2.2中不同濃度的抗氧化劑1 mL分別加人瓶中,然后加入0.1%的過氧化氫1mL,以蒸餾水補(bǔ)足體積,搖勻后于37℃水中溫育30 m in,測510 nm 處的吸光度值A(chǔ)0.空白實(shí)驗(yàn)以等量蒸餾水代替抗氧化劑溶液,測定其吸光值A(chǔ)x.以1mL 6mmol/L FeSO4和1 mL 0.1%H2O2加抗氧化劑溶液調(diào)節(jié)零點(diǎn),以扣除試樣本身顏色的影響.平行測定3次,取平均值.計(jì)算并比較幾種抗氧化劑對羥基自由基的清除率.

3 結(jié)果與討論

3.1 蘄艾鞣酸對超氧陰離子自由基的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基,然后分別加入1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mg/mL 蘄艾鞣酸、V c、和甘露醇溶液,于320nm 處測定吸光度.結(jié)果見表1,并得出3種抗氧化劑對超氧陰離子自由基的清除率(見圖1).

表1 3種抗氧化劑濃度與吸光度的關(guān)系(x±s,n=3)Tab.1 Relationship between concentration of three anti-oxidation and absorbance(x±s,n=3)

由圖1知,各抗氧化劑對超氧陰離子自由基清除作用隨濃度的增加而增大,濃度為10.0 mg/mL時(shí),蘄艾鞣酸、V c、甘露醇的清除率分別可達(dá)66.2%,96.7%,63.5%,但當(dāng)鞣酸濃度大于8.0 mg/mL時(shí),清除作用呈緩慢下降趨勢,因此鞣酸清除作用的最有效濃度為8.0 mg/mL,最大清除率為70.9%.

圖1 不同抗氧化劑對超氧陰離子自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of different anti-oxidation on O-2·free radical

直線回歸分析,當(dāng)濃度范圍為1.0～8.0 mg/mL得蘄艾鞣酸清除率回歸方程Y=42.298+3.724 4X,r=0.98統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明藥物濃度與清除率具有較好的線性關(guān)系,且成正相關(guān),說明蘄艾鞣酸此范圍對超氧陰離子自由基具有一定的清除作用,且成較好的量效關(guān)系.

3.2 蘄艾鞣酸對羥基自由基的清除作用

采用Fenten反應(yīng)體系產(chǎn)生羥自由基,分別加入1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mg/mL的蘄艾鞣酸、抗壞血酸和甘露醇溶液,于510 nm波長處測定吸光度.結(jié)果見表2,并得出3種抗氧化劑對羥自由基的清除率.結(jié)果見圖2.

表2 3種氧化劑的濃度與吸光度的關(guān)系(x±s,n=3)Tab.2 Relationship between concentration of three anti-oxidation and absorbance(x±s,n=3)

由圖1知,各抗氧化劑對羥自由基清除作用隨濃度的增加而增大,當(dāng)濃度為10.0 mg/mL時(shí),蘄艾鞣酸、V c、甘露醇的清除率分別可達(dá)71.3%,88.1%,67.2%,但當(dāng)鞣酸濃度大于8.0 mg/mL時(shí),清除作用呈緩慢下降趨勢,因此鞣酸清除作用的最有效濃度為8.0 mg/mL,最大清除率為74.2%.

直線回歸分析,當(dāng)濃度范圍為1.0～8.0 mg/mL得蘄艾鞣酸清除率回歸方程Y=43.971+4.011 6X,r=0.97統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明藥物濃度與清除率具有較好的線性關(guān)系,且成正相關(guān),說明在此范圍蘄艾鞣酸對羥自由基具有一定的清除作用,且成較好的量效關(guān)系.

圖2 不同抗氧化劑對羥自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of different anti-oxidation on·OH free radical

通過節(jié)3.1和節(jié)3.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,說明蘄艾鞣酸對超氧陰離子自由基和羥自由基均有較好的清除作用,并隨蘄艾鞣酸濃度的增加對自由基的清除能力增強(qiáng),但當(dāng)濃度大于6.0 mg/mL時(shí),清除趨勢放慢,清除率變化不大,當(dāng)濃度大于8.0 mg/mL時(shí),清除呈下降趨勢.可見蘄艾鞣酸對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除均具有一定的飽和效應(yīng),低濃度時(shí)清除很快,且有較好的量效關(guān)系.蘄艾鞣酸清除自由基的過程存在飽和機(jī)制,是由于鞣酸對自由基的清除作用是分子與分子間的反應(yīng).當(dāng)鞣酸摩爾濃度小于自由基摩爾濃度時(shí),隨著鞣酸濃度增加,清除率增加.但當(dāng)鞣酸摩爾濃度達(dá)到并超過自由基摩爾濃度時(shí),每個(gè)鞣酸分子可能無法找到其清除的自由基對象,摩爾濃度的自由基清除率便開始下降.

由圖1和圖2可見V c和甘露醇同樣存在濃度飽和效應(yīng),但3個(gè)物質(zhì)出現(xiàn)飽和現(xiàn)象的拐點(diǎn)不同.V c和甘露醇分別為4.0 mg/mL,而鞣酸6.0 mg/mL.基于清除自由基與自由基是分子與分子間的反應(yīng),因而需使用摩爾濃度進(jìn)行衡量.筆者在不知鞣酸分子量情況下代之以重量濃度衡量.就理論而言,由于各物質(zhì)對抗自由基的能力不同,而不應(yīng)使用重量濃度衡量.假定抗自由基分子與自由基分子存在一個(gè)等摩爾(1∶1)反應(yīng)關(guān)系,當(dāng)自由基摩爾濃度確定時(shí),則不同清除自由基物質(zhì)出現(xiàn)飽和的摩爾濃度也應(yīng)一致,因而可按出現(xiàn)飽和拐點(diǎn)時(shí)物質(zhì)的摩爾濃度計(jì)算未知物質(zhì)的平均分子量.分子量V c為176.1,甘露醇為182.2,由計(jì)算可初步估計(jì)蘄艾鞣酸平均分子量為273.3;總鞣酸為混合物,平均分子量較單一鞣酸分子的分子量低,鞣酸分子量一般在500～3000[10],說明混合鞣酸中還存在很多不具有清除自由基作用的雜質(zhì)存在,純凈鞣酸的清除效果應(yīng)更好,此結(jié)論需進(jìn)一步對蘄艾鞣酸的種類和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究而予確認(rèn).

將鞣酸、V c和甘露醇的質(zhì)量濃度換算成摩爾濃度并對上述圖2和圖3進(jìn)行修正,得到清除率同摩爾濃度的變化曲線見圖3和圖4.由2圖結(jié)果可知,蘄艾鞣酸確實(shí)具有體外清除超氧陰離子自由基和羥自由基的作用,且清除效果均強(qiáng)于甘露醇而不及V c.

圖3 不同抗氧化劑對超氧陰離子自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of different anti-oxidation on O-2·free radical

圖4 不同抗氧化劑對羥自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of different anti-oxidation on·OH free radical

4 結(jié)語

本研究結(jié)果表明,蘄艾鞣酸可通過清除活性氧自由基發(fā)揮抗氧化作用,對羥自由基和超氧陰離子自由基具有較強(qiáng)的清除作用,且其清除作用優(yōu)于常用的食品添加劑甘露醇,說明蘄艾鞣酸為一種較強(qiáng)的抗氧化劑和活性氧清除劑,具有延緩衰老的功效.可作為藥品、化妝品、食品進(jìn)行廣泛應(yīng)用.

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Scavenging of Hydroxyl and Superoxide Free Radical by Tann in fromA rtem isia argyi

H ong Zongguo,Y i Yun,W ang D ong
(College of Pharmacy,South-CentralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China)

Hydroxyl free radical,·OH and superoxide anion free radical,O-2· scavenging effects of the total tannin fromA etem siae argy iwere studied.The results showed that theA etem siae argy itotal tannin,1～10 mg/mL in vitro had scavenging activity on hydroxyl and superoxide radical by the autoxidation of pyrogallol production at the concentration of 1.0～10.0 mg/mL w ith dose dependent mode.The available concentration of scavenging activity on hydroxyl radical and superoxide radicalwas 8.0 mg/mL.A rtem isia argy iscavenging activity on radical were more than mannitol,but less than vitam in C at the same concentration

A etem siae argy itotal tannin;hydroxyl radical;superoxide;anti-oxidation effect

Q 504;Q 949.783.5

A

1672-4321(2011)01-0050-04

2010-07-14 ＊通訊聯(lián)系人 易 筠(1985-),女,碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué),E-mail:crystalyexuan@qq.com

洪宗國(1958-),男,教授,研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué),E-mail:hongzongguo@yahoo.com.cn

湖北省科技攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2006AA 302A 01)