李杰，尹蓉莉，李東芬，呂懿平，趙明琴

夏天無系罌粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens（Thunb.）Pers.的干燥塊莖，具活血止痛、舒經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)除濕等功效。主治高血壓、腦血管引起的中風(fēng)偏癱，并對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛、小兒麻痹后遺癥等有較好的作用，其主要活性成分為生物堿類。將夏天無總生物堿制成滲透泵控釋制劑可以減少服用次數(shù)，增加病人適應(yīng)性，減少藥物在體內(nèi)的峰谷現(xiàn)象，同時(shí)提高藥物的安全性、有效性、適應(yīng)性和可控性。本實(shí)驗(yàn)旨在優(yōu)選出一種適合分離純化夏天無總生物堿的大孔樹脂，并對(duì)優(yōu)選出的大孔樹脂分離夏天無總生物堿時(shí)的工藝條件及參數(shù)進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明篩選出的工藝簡(jiǎn)單可行，能夠滿足夏天無總生物堿滲透泵控釋片制劑的生產(chǎn)需求。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

RE-53C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-DIII型循環(huán)水式真空泵 (浙江黃巖求精真空泵廠)；79HW-1恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；BP61型電子分析天平(上海精科儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械七廠）；UV1100紫外/可見分光光度儀（上海天美）；DL-720D 數(shù)控超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；F-160型粉碎機(jī)（北京光明醫(yī)療儀器廠）：夏天無藥材（亳州市安東藥業(yè)有限責(zé)任公司）、原阿片堿對(duì)照品(110853-200201)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；95%乙醇、濃鹽酸、氯仿、溴甲酚紫、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（成都市科龍化工試劑廠）；D101、AB-8、HPD722、HPD400、X-5型大孔吸附樹脂（滄州寶恩化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 夏天無總生物堿含量測(cè)定方法[1]

酸性染料比色法：酸水溶解樣品，以溴甲酚紫作離子對(duì)，用磷酸鹽緩沖液作水相，氯仿為有機(jī)相提取夏天無總生物堿與溴甲酚紫形成的呈色離子對(duì)，以原阿片堿為對(duì)照品，比色法測(cè)定夏天無總生物堿。

2.2 夏天無提取液的制備

將夏天無藥材粗粉1 kg，用1%HCl 溶液10 L作為溶劑，充分浸漬48 h后，進(jìn)行滲漉操作，得到總堿提取液。

2.3 大孔樹脂預(yù)處理

將大孔樹脂用95%的乙醇浸泡24 h，使其充分膨脹，濕法裝柱，然后用95%的乙醇液洗至流出液加適量純水無白色渾濁現(xiàn)象，再用去離子水洗凈乙醇，直至流出液無渾濁為止。

2.4 樹脂型號(hào)的篩選

取過量夏天無提取液5份各150 mL，置具塞錐形瓶中，分別加入5種型號(hào)的大孔樹脂(D101、AB-8、X-5、HPD722、HPD400)各3 g，每10 min振搖一次，振搖2 h，靜置過夜，使達(dá)飽和吸附。過濾大孔樹脂，分別取各樹脂吸附后的溶液測(cè)定總生物堿的含量。再取吸附飽和的樹脂，分別加入95%乙醇，振搖2 h，靜置過夜，濾過，分別測(cè)定濾液中總生物堿的含量。計(jì)算夏天無總生物堿的提取率（解析后所得的總生物堿量與原提取液中總生物堿量的比值）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 5種大孔樹脂對(duì)夏天無總生物堿的提取率

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，HPD722型大孔樹脂分離純化夏天無總生物堿提取率較高，故確定選用HPD722型大孔樹脂。

2.5 最大上樣量的考察

將處理完畢的HPD722濕樹脂裝柱，使樹脂柱的徑高比約為1∶8（r=1.5cm，V=20ml），將滲漉液上樣，收集流出液，分別測(cè)定每個(gè)床體積(Bed Volume,BV)流出液中總堿的濃度，繪制出總堿的泄漏曲線。結(jié)果見圖1。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，總生物堿在第8份時(shí)出現(xiàn)較大泄漏，所以確定最大上樣量為7倍柱體積。

2.6 上樣流速考察

取5份經(jīng)預(yù)處理的HPD722型濕樹脂，按“2.5”項(xiàng)確定的方法上樣，分別以1 BVh-1、2 BVh-1、3 BVh-1、4 BVh-1的流速上樣，收集柱后液，測(cè)定7份柱后液中總生物堿的含量，計(jì)算總生物堿吸附量。結(jié)果見表2。

表2 總生物堿吸附量/mg

由結(jié)果可知，隨著流速的增大，大孔樹脂對(duì)總生物堿吸附量有減小的趨勢(shì)，但1 BVh-1、2 BVh-1、3 BVh-1相差不大，為節(jié)省成本，確定上樣流速為3 BVh-1。

2.7 雜質(zhì)洗脫劑用量的考察

取3份經(jīng)預(yù)處理的HPD722型濕樹脂，按“2.5”和“2.6”項(xiàng)確定結(jié)果上樣，分別用去離子水、0.2% 氨水以1 BVh-1進(jìn)行洗脫，每1 BV接收1份，測(cè)定總生物堿的含量，同時(shí)觀察洗脫液的顏色，確定洗脫劑的用量。結(jié)果見表3。

表3 兩種雜質(zhì)洗脫劑總生物堿含量/mgmL-1

表3 兩種雜質(zhì)洗脫劑總生物堿含量/mgmL-1

序號(hào) 1 2 3 4 5 6去離子水 0.847 1.044 1.166 1.077 0.989 0.910 0.2% 氨水 0 0 0 0 0 0

由結(jié)果可知，去離子水洗脫時(shí)有部分生物堿損失，而0.2%氨水能保證生物堿不被洗脫下來，所以選定0.2%氨水為雜質(zhì)洗脫劑。通過觀察去離子水洗脫到6個(gè)柱體積后，洗脫液顏色已較淺，水溶性雜質(zhì)基本上已經(jīng)洗掉，確定雜質(zhì)洗脫劑用量為6個(gè)柱體積。

2.8 洗脫劑濃度及用量的選擇

取3份經(jīng)預(yù)處理的HPD722型濕樹脂裝柱，按“2.5”、“2.6”和“2.7”項(xiàng)確定結(jié)果上樣并洗脫雜質(zhì)，分別以55%乙醇、75%乙醇和95%乙醇洗脫吸附在樹脂柱上的總生物堿，每1 BV接收1份，檢測(cè)總生物堿的含量，以洗脫液中總生物堿含量為指標(biāo)，確定乙醇濃度及用量。結(jié)果見表4。

表4 3種洗脫劑中總生物堿含量/mgmL-1

表4 3種洗脫劑中總生物堿含量/mgmL-1

序號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 55%乙醇 3.934 1.313 2.136 0.431 0.347 0.288 0.263 75%乙醇 4.763 0.926 0.910 0.733 0.872 1.632 0.889 95%乙醇 4.077 4.813 2.359 0.750 0.300 0.032 0.000

由結(jié)果可知，洗脫6個(gè)柱體積時(shí)，95%乙醇總生物堿含量已經(jīng)很低，55%乙醇和75%乙醇仍含有一定量總生物堿，考慮到成本，確定總生物堿洗脫劑為95%乙醇，洗脫體積為5個(gè)柱體積。

2.9 洗脫速度的考察

取經(jīng)預(yù)處理的HPD722型濕樹脂4份，按前幾項(xiàng)下確定結(jié)果上樣并洗脫雜質(zhì)，用5倍柱體積的95%乙醇分別以0.5、1、1.5、2BVh-1的流速洗脫，收集洗脫液，測(cè)定其中總生物堿的含量，計(jì)算洗脫率。結(jié)果見表5。

2.1 0 純化工藝驗(yàn)證

取夏天無粗粉3kg滲漉提取，取滲漉液平均分成3份，按最佳工藝經(jīng)大孔樹脂分離純化，減壓回收乙醇，真空干燥后得到總堿粉末。經(jīng)測(cè)定，3份精制物中總生物堿含量分別達(dá)到：77.2%、74.8%、75.5%，說明工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

綜上考察，5種大孔樹脂中，HPD722最適合分離夏天無總生物堿，最佳工藝條件為：上樣量為7BV；上樣流速為3 BVh-1；0.2%氨水液6BV洗脫雜質(zhì)；95%乙醇洗脫總生物堿，洗脫體積為5BV，洗脫速度為1 BVh-1。采用本實(shí)驗(yàn)確定的工藝，分離純化后的總生物堿含量可達(dá)70%以上，滿足夏天無總生物堿滲透泵控釋片的制劑需求。

[1] 廖靜,梁文藻.酸性染料比色法測(cè)定不同產(chǎn)地夏天無中總生物堿的含量[J].中草藥,1993,24(7):354.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部) [S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010年.

[3] 趙大洲,戴勝軍.大孔樹脂分離夏天無總生物堿的研究[J].中成藥,2006,28(2):182.