郭瑩輝

(廊坊市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,河北 廊坊 065000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥,由DN引起的終末期腎病發(fā)生率逐年升高[1]。有研究證實(shí),糖尿病腎病時(shí)腎組織細(xì)胞的過度凋亡與腎臟損害密切相關(guān)[2]。保腎寧方以糖尿病腎病陰虛燥熱、傷津耗氣、久病入絡(luò)、瘀血阻滯、毒損脈絡(luò)、脾腎虧虛的病機(jī)特點(diǎn)為基礎(chǔ),結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論及臨床經(jīng)驗(yàn)而擬定,為了進(jìn)一步驗(yàn)證其治療作用,筆者觀察了保腎寧提取液對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響,以探討保腎寧提取液對(duì)DN大鼠腎臟防治作用的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠50只,體質(zhì)量180～200 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 藥品及試劑

保腎寧提取液由黃芪、黨參、女貞子、麥冬、葛根 、大黃 、茯苓 、丹皮、川芎、水蛭、鬼箭羽(均購(gòu)自同仁堂藥房,符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn))組成,水煎醇提后濃縮至含生藥3.15 g?mL-1。貝那普利(商品名:洛丁新,北京諾華有限公司生產(chǎn),規(guī)格:10 mg?片-1),格列喹酮(商品名:糖適平,德國(guó)柏林格殷格翰國(guó)際公司與北京萬(wàn)輝藥業(yè)集團(tuán)合作制造,規(guī)格:30 mg?片-1)。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,兔抗Bax和Bcl-2單克隆抗體均為美國(guó)Calbiochem公司產(chǎn)品,TUNEL試劑盒由北京中山生物技術(shù)有限公司提供。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

將50只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)抽取10只SD大鼠暴露右側(cè)腎臟后縫合(為假手術(shù)組);其余40只行右腎切除術(shù),2周后切口愈合,按50 mg?kg-1腹腔注射 STZ(溶于 0.1 mol?L-1、pH=4.5的枸椽酸鈉緩沖液中),48 h后測(cè)血糖≥16.7 mol?L-1,尿糖?～為成模[3]。40只SD大鼠成模35只,按隨機(jī)數(shù)字表法選取30只分為模型組、西藥組、保腎寧組3組,每組10只。給藥方法:1)模型組:蒸餾水10 mL?kg-1?d-1);2)西藥組:貝那 普利1.7 mg?kg-1?d-1+糖適平5 mg?kg-1?d-1;3)保腎寧組:保腎寧提取液0.1 mL?kg-1?d-1;4)假 手 術(shù) 組:蒸 餾 水10 mL?kg-1?d-1,各組均灌胃給藥,時(shí)間8周。?

2.2 檢測(cè)方法

1)血、尿生化指標(biāo)測(cè)定:用日立7071A全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):操作流程按試劑盒標(biāo)明的方法進(jìn)行。蛋白表達(dá)定量分析按照O.Morkve等[4]提出的方法,以熒光指數(shù)(FI)表示其相對(duì)含量。FI=(樣品蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度-對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度)/正常對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度,FI＞1.0為陽(yáng)性表達(dá),FI＜1.0為陰性表達(dá)。3)原位末端標(biāo)記法(T UNEL):按試劑盒標(biāo)明的方法進(jìn)行,顯微鏡下觀察,TUNEL陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒。腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)=100個(gè)腎小管的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/100個(gè)腎小管細(xì)胞總數(shù);腎小球的凋亡指數(shù)用平均單個(gè)腎小球切面的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)作為比較指標(biāo)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel軟件及SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較

與模型組相比,西藥組及保腎寧組大鼠血清BUN、Scr、Upro均明顯降低(P ＜0.01),見表1。

表1 各組大鼠血清BUN、Scr、Upro比較

表1 各組大鼠血清BUN、Scr、Upro比較

*P＜0.01與假手術(shù)組比較;△P＜0.01與模型組比較。

組別 n BUN ρ/(mmol? L-1)Scr ρ/(μ mol? L-1)Upro(24 h)m/mg假手術(shù)組 10 3.96±0.25 69.74±6.78 3.33±1.74模型組 10 15.78±2.17* 192.42±7.56* 16.27±3.75*西藥組 10 9.15±0.78*△ 98.64±11.84*△ 6.45±4.22*△保腎寧組 10 8.02±1.32*△ 96.53±9.65*△ 7.39±2.61*△

3.2 各組大鼠腎組織中Bcl-2、Bax表達(dá)比較

保腎寧組及西藥組與模型組比較,可升高Bcl-2、降低Bax的平均光密度值(P＜0.01);保腎寧組在升高Bcl-2、降低Bax方面效果優(yōu)于西藥組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腎組織中Bcl-2、Bax表達(dá)比較

表2 各組大鼠腎組織中Bcl-2、Bax表達(dá)比較

*P＜0.01與模型組比較;△P＜0.05與西藥組比較。

組別 n Bcl-2/FI Bax/FI假手術(shù)組 10 1.01±0.12 1.00±0.11模型組 10 0.80±0.14 1.49±0.16西藥組 10 1.05±0.11* 1.08±0.09*保腎寧組 10 1.14±0.15*△ 1.02±0.05*△

3.3 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況比較

西藥組及保腎寧組與模型組比較,均能明顯降低腎小球及腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)(P＜0.01);保腎寧組在降低腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)方面明顯低于西藥組(P＜0.05),見表3。

表3 各組大鼠腎小球及腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

表3 各組大鼠腎小球及腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

*P＜0.01與模型組比較;△P＜0.05與西藥組比較。

組別 n 腎小球細(xì)胞凋亡指數(shù) 腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)假手術(shù)組 10 0.04±0.12 3.88±0.15模型組 10 0.64±0.13 12.89±0.28西藥組 10 0.40±0.15* 7.62±0.27*保腎寧組 10 0.29±0.09* 4.98±0.09*△

4 討論

細(xì)胞凋亡就是細(xì)胞死亡,廣義的講,細(xì)胞凋亡可包括細(xì)胞壞死、溶解和程序性死亡等;狹義地講,是指細(xì)胞程序性死亡[5]。DN早期機(jī)體通過細(xì)胞凋亡清除增生的多余細(xì)胞是有益的,但晚期凋亡細(xì)胞數(shù)往往與腎功能惡化程度成正比[6]。有報(bào)道證實(shí)糖尿病模型腎組織中細(xì)胞凋亡數(shù)較非糖尿病腎臟明顯增多,并伴有凋亡相關(guān)基因的改變[7]。Bcl-2是一個(gè)基因家族,Bax是Bcl-2基因家族中的一個(gè)同源蛋白,Bcl-2主要功能是促細(xì)胞生存,延長(zhǎng)細(xì)胞壽命,抑制細(xì)胞凋亡,Bax主要作用是促細(xì)胞凋亡,Bcl-2與Bax的比例對(duì)細(xì)胞凋亡有調(diào)節(jié)作用[6]。

糖尿病腎病屬于中醫(yī)學(xué)的“消渴”、“水腫”、“虛勞”的范疇,DN病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí),本虛為氣血陰陽(yáng)、五臟虧虛,標(biāo)實(shí)為血瘀、痰凝、濕阻、水停、濁毒內(nèi)生等。筆者根據(jù)中醫(yī)理論結(jié)合長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn),以滋陰降火、化瘀瀉濁、健脾益腎為大法,擬定保腎寧方。方中以黃芪、黨參為君藥,健脾益氣,補(bǔ)氣生津,配以女貞子、麥冬,益腎滋陰清熱,加用川芎、水蛭、大黃等藥以祛瘀血、水濕、濁毒之邪。有研究表明,黃芪具有擴(kuò)管、降壓、利尿作用,能增加腎血流量,反饋性的抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng),增加氧化物的代謝,達(dá)到改善腎功能的目的[8];鬼箭羽能夠降低DN大鼠的血糖,同時(shí)使DN大鼠的高、低切變率下的全血黏度明顯下降[9];丹參能有效地抑制梗阻性大鼠腎組織中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性,減少血管緊張素Ⅱ含量,進(jìn)而保護(hù)腎臟。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),保腎寧提取液能夠明顯改善DN大鼠腎功能,降低24 h尿蛋白排泄率,保腎寧提取液對(duì)Bax/Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)及腎臟細(xì)胞凋亡的干預(yù),可能是其保護(hù)腎臟的作用機(jī)制之一。

[1]潘長(zhǎng)玉,金文勝.2型糖尿病流行病學(xué)[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2005,21(5):i0001-i0005.

[2]趙玲,顧江萍,栗德林,等.細(xì)胞凋亡與糖尿病腎病的關(guān)系及糖腎康作用機(jī)制的研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2003,4(8):439-442.

[3]張洪俊.從《內(nèi)經(jīng)》看糖尿病遷延不愈的機(jī)理與治療[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2004,2(10):26-27.

[4]Morkve O,Laerun O D.Flow cytometric measurement of p53 protein expression and DNA content in paraffin embedded tissue from bronchial carcinomas[J].Cytometry,1991,12:438-444.

[5]陳慰峰.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:158-213.

[6]Sugiyama H,Kashihara N,M akino H,et al.Apoptosis in glomerular sclerosis[J].Kidney Int,1996,49:103-111.

[7]張艷玲,段惠軍,郝文田,等.苯那普利對(duì)糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及 Bax和Bcl-2表達(dá)的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2001,23(4):237-239.

[8]嚴(yán)萍萍,張文芳,李勇,等.黃芪注射液對(duì)心力衰竭患者神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響[J].中華實(shí)用中西醫(yī)雜志,2004,17(21):3188-3190.

[9]尚文斌.鬼箭羽對(duì)糖尿病小鼠血糖及全血粘度的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2000,16(3):166-167.