聶東宋,劉 宇,吳 喆,劉立超,朱政斌

(湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 岳陽 414006)

莽山烙鐵頭蛇粗毒雙向凝膠電泳分析

聶東宋,劉 宇,吳 喆,劉立超,朱政斌

(湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 岳陽 414006)

采用固相 pH 梯度等電點(diǎn)聚焦-SDS 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)莽山烙鐵頭粗毒進(jìn)行了分析,通過銀染法顯色,電腦軟件識(shí)別出約40個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn).其中分子量超過130 kD 的蛋白質(zhì)點(diǎn)很少,分子量90 kD～10 kD 的區(qū)域均有蛋白質(zhì)點(diǎn)分布,分子量34 kD區(qū)域的蛋白質(zhì)點(diǎn)較為密集,且它們的含量明顯較高.從蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)分布范圍分析,偏于堿性端的蛋白質(zhì)明顯多于酸性端的蛋白質(zhì),且分布在中性偏堿( pH 7～8)的區(qū)域.質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋結(jié)果表明:莽山烙鐵頭蛇毒中含有類凝血酶組分、纖溶酶組分、血小板聚集蛋白、抗血小板聚集蛋白和平滑肌鈣離子通道阻斷劑等組分.

莽山烙鐵頭蛇毒;二維電泳;蛋白質(zhì)組

蛇毒的研究是天然動(dòng)物毒素研究的一個(gè)重要領(lǐng)域,蛇毒是一個(gè)潛在的發(fā)現(xiàn)新的生物活性分子的重要資源[1].國(guó)內(nèi)外的研究表明,無論在基礎(chǔ)理論還是應(yīng)用研究上,蛇毒作為新型生物醫(yī)藥的分子模板、神經(jīng)生物學(xué)研究的工具試劑、新型生物殺蟲劑的先導(dǎo)分子和蛋白質(zhì)工程的框架分子等方面的研究均有不可替代的功能[2～4].

莽山烙鐵頭蛇是中國(guó)湖南莽山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)特有大型劇毒蛇種,根據(jù)莽山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)陳遠(yuǎn)輝的調(diào)查[5],莽山烙鐵頭蛇是我國(guó)瀕臨滅絕的物種,目前只在莽山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)發(fā)現(xiàn),并且數(shù)量只有大概300～500條,由于遭到非法捕獵,其數(shù)量日益減少.目前對(duì)莽山烙鐵頭蛇毒毒液的研究非常少,只對(duì)莽山烙鐵頭蛇毒素中的PLA2成分進(jìn)行了部分研究[6～8].

傳統(tǒng)的蛇毒素分離多采用柱層析法,該方法雖然有制備量大的優(yōu)點(diǎn),但難于使大多數(shù)組分同時(shí)得到分離,且很多含量很少的成分常被遺漏.蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)和其他微量分離分析技術(shù)的發(fā)展,正推動(dòng)動(dòng)物毒素的研究從單個(gè)毒素研究發(fā)展到毒素組研究,特別是雙向凝膠電泳和多維色譜與現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合,使得分析一個(gè)動(dòng)物毒腺中的全部毒素分子成為可能[2～4].目前,用雙向凝膠電泳技術(shù)對(duì)莽山烙鐵頭蛇毒毒素進(jìn)行分離并進(jìn)而進(jìn)行鑒定的工作尚未見報(bào)導(dǎo).本文報(bào)道采用固相pH 梯度-SDS 雙向電泳技術(shù)對(duì)我國(guó)特有瀕危物種莽山烙鐵頭蛇粗毒進(jìn)行分析鑒定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

1 材料和方法

1.1 試劑

固相 pH 梯度干膠條( pH3～10,L 13 cm)、載體兩性電解質(zhì)( pH3～10)、IPG 緩沖液( pH3～10)和覆蓋液為Pharmacia 公司產(chǎn)品;二硫蘇糖醇、碘乙酰胺為Sigma 公司產(chǎn)品;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、Tris、CHAPS、SDS、甘氨酸為Amresco 公司產(chǎn)品;雙向電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白與低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白購(gòu)自上海伯奧生物制品公司.

1.2 儀器設(shè)備

Multiphor Ⅱ電泳單元、 EPS 3500 電泳儀等電聚焦電泳系統(tǒng)( pharmacia 公司), Bio-Rad Protein Ⅱ垂直板電泳槽,Gel Do c2000 凝膠成像儀,PDQUEST 2D膠分析軟件( Bio-Rad 公司).質(zhì)譜儀為英國(guó)Micromasss公司的電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜 Micro Q-TOF,配備有毛細(xì)管液相色譜儀(CapLC)和鈉升噴霧源.

1.3 生物材料

莽山烙鐵頭蛇粗毒由湖南省宜章縣境內(nèi)莽山自然保護(hù)區(qū)陳遠(yuǎn)輝提供,冷凍干燥后使用.

1.4 第一向固相pH 梯度等電聚焦電泳

基本按Bjellguist[9]的方法進(jìn)行,取pH3～10L,13cm干膠條,揭去保護(hù)膜,置干膠條于水化槽中進(jìn)行水化(水化液組成為:脲12.0 g ,CHAPS 0.5 %,pharmalyte 3-10 為0.13 ml,DTT 50 mg,加水定容至25 ml,并加入少量溴酚藍(lán)),水化時(shí)間16～18 h.取出膠條放入Multphor Ⅱ電泳單元塑料平行溝槽板的溝槽中,安置好電極及樣品杯,每個(gè)樣品杯點(diǎn)樣50～100μl,加入70～80 ml 石蠟油完全覆蓋膠條,連接EPS3500電源,按以下三個(gè)程序進(jìn)行電泳:(1)300Ⅴ,1 mA,4.5h;(2)2000 Ⅴ,3mA,5h;(3)2500Ⅴ,1mA,6.5h.電泳完畢,從槽中取出膠條,加入平衡液A 振蕩平衡10 min,再換平衡液B 振蕩平衡10 min,取出膠條,準(zhǔn)備第二向電泳.

1.5 第二向SDS-PAGE 垂直平板電泳

按Bjellguist[9]的方法進(jìn)行,采用分離膠濃度為15 %的不連續(xù)SDS-PAGE 垂直板電泳.將已平衡好的膠條置于第二向凝膠頂端,排除氣泡,使二者緊密接觸,用1%瓊脂糖凝膠封固膠條,接通電源,并通15℃左右的循環(huán)冷卻水冷卻.20mA 恒流電泳,待溴酚藍(lán)遷移至分離膠與濃縮膠的界面處,再將電流升至 40 mA恒流電泳,待溴酚藍(lán)前沿距凝膠板底邊1cm 處,即可停止電泳,準(zhǔn)備剝膠和染色.

1.6 銀染

取出凝膠板,置于固定液中,30min后,換敏化液敏化 30min,倒去敏化液,以雙蒸水洗 3 次,每次5min,然后置于銀染試劑中染色20min,再以雙蒸水洗2 次,每次1min,加顯影劑,至蛋白質(zhì)點(diǎn)完全顯現(xiàn)為止.倒去顯影試劑,立即換終止液終止顯色,10min 后以雙蒸水洗滌3 次,每次5min,然后置于保存液中,30min 后,再換一次保存液保存,留待掃描及進(jìn)行圖像分析.

1.7 蛋白質(zhì)的原位酶解

蛋白質(zhì)的原位酶解參照陳平等[10]的方法稍作修改,主要過程如下:(1)脫色:銀染的蛋白質(zhì)點(diǎn)割下后置于EP管中,用雙蒸水沖洗兩次后加入新鮮制備的脫色工作液(30 mmol/L K3Fe(CN)6∶100 mmol/ L Na2S2O3= 1∶1)50μl,約1～2 min 后可見蛋白質(zhì)點(diǎn)的棕色消失,此時(shí)馬上用水沖洗停止反應(yīng).將溶液去除后把膠切成小塊,并用200mmol/L 的NH4HCO3沖洗,用純乙腈脫水至膠塊變?yōu)榘咨笾糜谡婵崭稍锉弥谐楦?(2)還原和烷基化:在上述每管樣品中加入50μl 100 mmol/ L NH4HCO3(含DTT 10 mmol/L),57 ℃保溫1h后室溫冷卻,去掉過量液體,迅速加入同樣體積的用100mmol/L NH4HCO3新鮮配制的55mmol/L碘乙酰胺,室溫暗處放置30min ,反應(yīng)完成后用100mmol/ L的NH4HCO3沖洗兩次,再用乙腈脫水后加入等體積的100mmol/L NH4HCO3,凍干.(3)酶解:TPCK2胰蛋白酶用50mmol/ L 的NH4HCO3(含5mmol/L CaCl2)配成0.1g/ L 的溶液,每管抽干的膠塊中加入約10μl 讓其膠塊吸收,膠塊吸脹后將多余酶液吸去,再加入20μl不含酶的緩沖液覆蓋,37 ℃過夜消化.(4)萃取:酶解后的肽用50μl 5 % TFA/ 50 % ACN 萃取兩次,合并萃取液凍干后進(jìn)行質(zhì)譜分析.

1.8 Q-TOF MS分析

酶解產(chǎn)物鑒定用質(zhì)譜儀為英國(guó)Micromasss公司的電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜Micro Q-TOF,配備有毛細(xì)管液相色譜儀(CapLC)和鈉升噴霧源.樣品進(jìn)行 CapLC-ESI-MS/MS全自動(dòng)分析,毛細(xì)管 HPLC裝備一個(gè)C18脫鹽預(yù)柱(5mm×320um),毛細(xì)管柱為C18(15cm×75um),樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)入預(yù)柱,由C泵以30ul/min的流速將樣品脫鹽3分鐘后,經(jīng)C18毛細(xì)管柱梯度洗脫進(jìn)行肽段分離,梯度可根據(jù)樣品情況設(shè)定,本次實(shí)驗(yàn)的梯度為60 min中乙晴濃度5 %-50 %,流速3 ul/min,柱前分流使進(jìn)柱流速0.3ul/min,分離后的肽段直接進(jìn)入ESI離子源,對(duì)于強(qiáng)度超過閾值的肽段自動(dòng)進(jìn)行MS/MS測(cè)定.所有MS測(cè)定均在正離子模式下進(jìn)行.質(zhì)譜儀的校正是用PPG-2000的串聯(lián)碎片校正的,質(zhì)量誤差為±0.1Da.

1.9 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋

質(zhì)譜數(shù)據(jù)以pkl.的文件格式提交Mascot搜索(網(wǎng)站http:www.matrixscience.com),數(shù)據(jù)庫(kù)選NCBInr,物種選 Human,最大允許的片段離子質(zhì)量誤差為 0.5Da,肽質(zhì)量是單一同位素質(zhì)量,胰蛋白酶消化,最多允許1個(gè)不完全裂解位點(diǎn),半胱氨酸為脲甲基半胱氨酸(Carbamidomethyl-Cys).

2 結(jié)果與討論

2.1 莽山烙鐵頭蛇粗毒的雙向電泳圖譜

圖1為1mg 莽山烙鐵頭蛇粗毒干粉在固相pH梯度(3～10L)-SDS 雙向電泳凝膠板上分離后經(jīng)銀染得到的圖譜.采用PDQUEST 雙向凝膠電泳分析軟件可以識(shí)別40個(gè)左右的蛋白質(zhì)點(diǎn),我們?cè)群髮?duì)莽山烙鐵頭蛇粗毒通過離子交換層析與反相HPLC進(jìn)行分離,可以得到近10個(gè)組份(結(jié)果未顯示),上述2D 膠分析結(jié)果說明雙向電泳的靈敏度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的柱層析與HPLC方法.從展現(xiàn)蛋白質(zhì)點(diǎn)的分子量分布范圍來看,分子量超過130kD的蛋白質(zhì)點(diǎn)幾乎未見,分子量90kD至10kD的區(qū)域均有蛋白質(zhì)點(diǎn)分布,分子量34kD區(qū)域蛋白質(zhì)點(diǎn)較為密集,且它們的含量明顯較高.分子量10kD以下的蛋白質(zhì)點(diǎn)沒有大分子量的蛋白質(zhì)點(diǎn)集中,可能是粗毒中含有一些分子量較分散的多胺類物質(zhì)所致.從蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)分布范圍分析,偏于堿性端的蛋白質(zhì)明顯多于酸性端的蛋白質(zhì),尤其是分子量10kD以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)較多,且分布在中性偏堿( pH 7～8)的區(qū)域.

圖1 莽山烙鐵頭粗毒的雙向電泳圖譜

2.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋結(jié)果

電泳后的蛋白質(zhì)進(jìn)行回收并測(cè)得其肽指紋圖,根據(jù)肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù),同時(shí)測(cè)得蛋白質(zhì)質(zhì)量和N端測(cè)序,根據(jù)分析所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)搜索,質(zhì)譜數(shù)據(jù)以 pkl.的文件格式提交 Mascot搜索(http:www.matrixscience.com),最大允許的片段離子質(zhì)量誤差為 0.5Da,肽質(zhì)量是單一同位素質(zhì)量,胰蛋白酶消化,最多允許1個(gè)不完全裂解位點(diǎn),半胱氨酸為脲甲基半胱氨酸(Carbamidomethyl-Cys),質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋結(jié)果表明:莽山烙鐵頭蛇毒中含有類凝血酶組分、纖溶酶組分、絲氨酸蛋白酶、血小板聚集蛋白、抗血小板聚集蛋白和平滑肌鈣離子通道阻斷劑等20個(gè)組分.這些組成大部分為其它蛇類包括竹葉青、烙鐵頭、眼鏡蛇的同源蛋白等.具體搜索結(jié)果見表1.

表1 莽山烙鐵頭初毒質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋結(jié)果

由于莽山烙鐵頭的基因組和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)資源目前尚未建立,加之物種間相同功能蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)上的差異,上述鑒定結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證.相當(dāng)多的蛋白質(zhì)點(diǎn)雖獲得肽質(zhì)譜指紋數(shù)據(jù),但在搜尋中未能找到與數(shù)據(jù)庫(kù)中誤差在0.5質(zhì)子單位以內(nèi)的已知蛋白質(zhì)的肽質(zhì)譜指紋,有可能這些蛋白質(zhì)是莽山烙鐵頭毒液中特有的蛋白質(zhì).下一步我們將對(duì)這些蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化與鑒定.

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Analysis of Two-Dimensional Electrophoresis of Toxin From the Ermia mangshanensis

NIE Dong-song,LIU Yu,WU Zhe,LIU Li-chao,ZHU Zheng-bin
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan Institute of Science and Technology,Yueyang 414006,China)

In this study,Crude venom of the Ermia mangshanensis snake was separated by two-dimensional gel electrophoresis ( 2D-PAGE)with the separation in the first dimension on a wide range immobilized pH ( 3- 10)gradient.The results showed that over 40 protein spots were presented on a silver stained 2D-gel.Molecular weight More than 130 kD were almost not detected.About 35 spots with relatively high concentration were located on the region among the molecular weight of 34 kD.The basic proteins are much more than the Acidic proteins within the range from pH 7～8.MS database search results showed that Ermia mangshanensis venom contained thrombin,plasmin components,platelet aggregation protein,anti-platelet aggregation protein,smooth muscle components of calcium channel blocking agents.

Ermia mangshanensis venom;two-dimensional electrophoresis;proteome

Q786

A

1672-5298(2011)01-0048-04

2010-12-03

湖南省教育廳科研項(xiàng)目(06C370);湖南省教育廳青年基金項(xiàng)目(07B029);湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃資助項(xiàng)目

聶東宋(1967? ),男,湖南衡陽人,湖南理工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院副教授.主要研究方向:新基因的克隆與功能