丁保清，張義軍，解美娜，李莎莎

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，濰坊 261053;2.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心，濰坊 261053)

哺乳期接觸雙酚A對子代雄鼠睪丸結(jié)構(gòu)及雌激素受體β表達(dá)的影響

丁保清1，張義軍1，解美娜2，李莎莎1

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，濰坊 261053;2.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心，濰坊 261053)

目的 研究哺乳期接觸雙酚A(BPA)對雄性小鼠睪丸結(jié)構(gòu)及雌激素受體β(ERβ)表達(dá)的影響。方法 20只妊娠母鼠，待分娩后隨機(jī)分為高、中、低劑量組，BPA染毒劑量為100、50、5 mg/(kg·d)和對照組，母鼠分娩后第2天開始每天灌服BPA，仔鼠通過乳汁暴露于BPA，一直持續(xù)到第22天斷奶，研究其成年后睪丸組織形態(tài)學(xué)改變，并用免疫組織化學(xué)、RT-PCR和Western blot方法研究BPA對其成年后睪丸內(nèi)ERβ表達(dá)的影響。結(jié)果 睪丸形態(tài)學(xué)分析表明BPA處理組睪丸發(fā)育受到嚴(yán)重影響，生精細(xì)胞排列紊亂，支持細(xì)胞和各級生精細(xì)胞生長受到不同程度的抑制;免疫組化、RT-PCR及Western blot均顯示，高、中、低劑量組雄鼠成年后睪丸組織中ERβ的表達(dá)均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)論 哺乳期接觸BPA影響雄鼠睪丸發(fā)育，改變其成年后睪丸形態(tài)，提高睪丸組織內(nèi)ERβ表達(dá)，提示BPA可能通過改變雌激素受體表達(dá)從而影響睪丸發(fā)育。

雙酚A;哺乳期;睪丸;雌激素受體β

雙酚A(bisphenol A，BPA)是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，有弱的雌激素活性，能進(jìn)入環(huán)境而被人類和野生動物長期慢性接觸，因其有脂溶性，不僅存在于食物、水、人類尿液、血液，在懷孕婦女的胎盤、羊水及母乳中也檢測到了 BPA［1-3］。妊娠期和哺乳早期階段是對雌激素樣活性物質(zhì)特別敏感的時(shí)期，母體染毒BPA后，可通過胎盤和乳汁傳遞給下一代，影響組織形成和發(fā)育，對人類和野生動物造成嚴(yán)重影響［4］。BPA可影響激素的水平，改變其靶組織的雌激素受體表達(dá)［5］。雌激素受體(estrogen receptor，ER)為核受體超家族成員之一，分為 ERα和ERβ［6，7］。在男性生殖系統(tǒng)中，ERβ 大量表達(dá)的組織是睪丸，成年ERβ主要見于生精細(xì)胞、精子細(xì)胞和支持細(xì)胞［8］。

目前有關(guān)BPA對發(fā)育中雄性小鼠生殖系統(tǒng)影響的研究還很少，以往對新生期暴露于BPA的實(shí)驗(yàn)多選擇皮下注射［9，10］，不能代表人類和動物的污染程度。另一方面，沒有令人信服的證據(jù)證明BPA是否改變睪丸結(jié)構(gòu)及組織內(nèi)ERβ的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用ICR妊娠母鼠灌服 BPA，仔鼠通過乳汁暴露于BPA的給藥方式，研究不同劑量雙酚A污染對其子代雄鼠睪丸結(jié)構(gòu)及組織中ERβ的表達(dá)量變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

懷孕的 ICR(Institute of Cancer Research)小鼠(Mus musculus)，購自上海實(shí)驗(yàn)動物中心【SYXK(滬)2007-0005】，體重38～40 g，動物質(zhì)量屬于一級標(biāo)準(zhǔn)。飼養(yǎng)于清潔級動物實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)環(huán)境控制在室溫(24±2)℃，相對濕度40% ～50%，飼喂顆粒料，自由飲清潔水，自動通風(fēng)，并按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物模型的制備：20只懷孕的ICR小鼠，待分娩后隨機(jī)分為高、中、低劑量組［BPA染毒劑量為100、50、5 mg/(kg·d)］和對照組，從分娩第 2 天起一直持續(xù)到第22天斷奶給母鼠每天灌服溶于食用玉米油的 BPA(Sigma-Aldrich公司，純度 99%)，BPA先用無水乙醇溶解，再用玉米油稀釋成所需濃度，配制成 40、20、2 mg/mL，灌胃體積為 2.5 mL/kg，即 3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組劑量分別為 100、50、5 mg/kg，對照組用食用玉米油灌胃作為試劑對照。斷奶后，雄性仔鼠與母鼠分籠飼養(yǎng)至成年，到第75天，雄鼠稱體重后處死，取一部分睪丸組織固定于4%甲醛中，另一部分置于DEPC處理過的凍存管中，標(biāo)記后放入-152℃冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 睪丸形態(tài)學(xué)分析：固定后的睪丸經(jīng)脫水、透明、浸蠟后包埋，制作成5 μm石蠟切片，HE染色后觀察睪丸形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測睪丸內(nèi) ERβ表達(dá)：5 μm厚的切片常規(guī)脫蠟入水，微波修復(fù)抗原，3%H2O2溶液孵育20 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗(5 min×3次)，正常山羊血清37℃孵育30 min，滴加1∶50稀釋的一抗ERβ(購自Santa Cruz Biotechnology Inc，商品號 SC-8974)，4℃ 過夜，以PBS代替一抗為陰性對照。PBS沖洗(5 min×3次)，滴加生物素化羊抗兔IgG二抗工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗(5 min×3次)，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗(5 min × 3次)，DAB(3，3-二氨基聯(lián)苯胺)顯色，然后按常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察染色情況。采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對ERβ表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.2.4 RT-PCR方法檢測睪丸內(nèi)ERβ：取新鮮凍存睪丸組織25 mg，按Trizol試劑盒(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)提供方法，提取總RNA，取總RNA 2 μL轉(zhuǎn)錄成 cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，取 β-actin作為內(nèi)參照。ERβ引物和β-actin引物由上海生物工程技術(shù)服 務(wù) 有 限 公 司 合 成，ERβ：forward 5′-CAGTAACAAGGGCATGGAAC-3′， reverse5′-GTACATGTCCCACTTCTGAC-3′，退火溫度 50℃，35 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增片 段 長 度 243bp; β-actin： forward 5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，reverse5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA3-′，退火溫度 48℃，30 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增片段長度452-bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果、照相，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，分別計(jì)算各組睪丸組織條帶的積分吸光度(IA)與相對的β-actin條帶 IA的比值，為各目的基因 mRNA表達(dá)的相對水平。

1.2.5 Western blot檢測睪丸組織 ERβ的表達(dá)：取新鮮凍存睪丸組織，按蛋白抽提試劑盒(明日百奧科技有限公司)提供方法，提取蛋白，采用 10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，積層膠時(shí)用80 V恒壓電泳，待溴酚蘭前沿進(jìn)入分離膠后，電壓改為120 V繼續(xù)電泳，總時(shí)間2 h左右。電泳后將凝膠中的蛋白通過半干轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，浸沒于5%奶粉封閉液中緩慢搖蕩1h。將膜置于1∶1000的 ERβ 2 mL或 1∶1000稀釋的β-actin抗體中4℃孵育過夜;用1‰ TBST在搖床上搖動漂洗膜三次，每次15 min;將膜置于 HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(1∶1000)2 mL中室溫輕搖孵育2 h;1‰ TBST搖動漂洗膜3次，每次15 min;ECL光試劑盒顯影、X片感光后顯影定影，清水沖凈晾干。

表2給出了對碟式太陽能熱發(fā)電系統(tǒng)進(jìn)行能量分析和 分析的結(jié)果。從表2可以看出最大的能量損耗發(fā)生在斯特林發(fā)電機(jī)，為42.27 kW，其次是集熱子系統(tǒng)，為19.38 kW。集熱子系統(tǒng)熱效率為77.87%，整個(gè)碟式太陽能熱發(fā)電系統(tǒng)的熱效率是29.67%。對碟式太陽能熱發(fā)電系統(tǒng) 分析的結(jié)果顯示，集熱子系統(tǒng)的 損失為33.14 kW，斯特林發(fā)電機(jī) 損失為22.44 kW。集熱子系統(tǒng)的 效率為59.37%。碟式太陽能熱發(fā)電系統(tǒng)的整體 效率31.88%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有免疫組化、RT-PCR及Western blot數(shù)據(jù)表示為(ˉx±s)，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 BPA對仔鼠成年后睪丸發(fā)育的影響

在對照組中，曲細(xì)精管內(nèi)的細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核飽滿豐富，在BPA處理組中，睪丸發(fā)育受到嚴(yán)重影響，生殖細(xì)胞排列層次發(fā)生不同程度的紊亂，管腔內(nèi)的精子細(xì)胞數(shù)目稀少，支持細(xì)胞和各級生精細(xì)胞生長受到不同程度的抑制，曲細(xì)精管管腔中出現(xiàn)大量胞質(zhì)殘余體，部分管腔出現(xiàn)潴留管腔液(圖 1，彩插 8)。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測睪丸組織ERβ蛋白和定量分析

免疫組織化學(xué)的結(jié)果表明ERβ主要為胞核表達(dá)，主要表達(dá)在支持細(xì)胞、初級精母細(xì)胞和次級精母細(xì)胞，個(gè)別間質(zhì)細(xì)胞胞核也表達(dá)，并且在不同的生精小管中有兩種形式的表達(dá)，部分生精小管內(nèi)ERβ只在支持細(xì)胞表達(dá)，而在另外一些生精小管除了支持細(xì)胞外精母細(xì)胞也有 ERβ的表達(dá)(圖2，彩插8)。圖像分析結(jié)果表明，高、中、低劑量組仔鼠成年后睪丸組織中單個(gè)陽性細(xì)胞ERβ的表達(dá)均高于對照組，平均吸光度值高于對照組(P＜0.01)(表1)。

2.3 RT-PCR檢測ERβ mRNA的表達(dá)

表1 接觸BPA后雄鼠睪丸中ERβ免疫組化分析(s，n=20)Tab.1 Immunohistochemistry analysis of the expression of ERβ in the testis of BPA-treated mice(s，n=20)

表1 接觸BPA后雄鼠睪丸中ERβ免疫組化分析(s，n=20)Tab.1 Immunohistochemistry analysis of the expression of ERβ in the testis of BPA-treated mice(s，n=20)

注：與對照組比較，**P＜0.01。Note：compared with the control group，**P ＜0.01.

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圖3 睪丸組織ERβ與β-actin mRNA的表達(dá)Fig.3 RT-PCR results of ERβ and β-actin mRNA experssion in the testis tissues

2.4 Western blot測定不同組別ERβ的表達(dá)情況

采用Gel-Pro圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析(表3)，高、中、低劑量組雄性睪丸組織中ERβ的表達(dá)均高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，且中、低劑量組比高劑量組增加明顯(圖4)。

表2 雄性小鼠成年后睪丸組織ERβ與β-actin mRNA比值(s，n=20)Tab.2 The IA ratio of ERβ/β-actin mRNA in the testis of adult male mice(s，n=20)

表2 雄性小鼠成年后睪丸組織ERβ與β-actin mRNA比值(s，n=20)Tab.2 The IA ratio of ERβ/β-actin mRNA in the testis of adult male mice(s，n=20)

注：與對照組比較，**P＜0.01。Note： compared with the control group，**P ＜0.01.

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表3 睪丸中ERβ蛋白表達(dá)的Western blot分析(s，n=20)Tab.3 Western blot analysis of the expression of ERβ protein in the testis of BPA-treated mice(s，n=20)

表3 睪丸中ERβ蛋白表達(dá)的Western blot分析(s，n=20)Tab.3 Western blot analysis of the expression of ERβ protein in the testis of BPA-treated mice(s，n=20)

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。Note： compared with the control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

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圖4 睪丸組織ERβ與β-actin蛋白的表達(dá)Fig.4 Western blot results of ERβ and β-actin protein experssion in the testis tissues

3 討論

最近幾年，對環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究已成為各國學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。已有大量證據(jù)表明BPA影響生殖系統(tǒng)的發(fā)育［11，12］，給哺乳期大鼠口服 C14標(biāo)記的BPA，發(fā)現(xiàn)一部分放射性物質(zhì)經(jīng)受試大鼠母乳轉(zhuǎn)移給新生仔鼠，證明 BPA可進(jìn)入母乳［12］。母體內(nèi)蓄積的BPA會使新生兒暴露于 BPA，另外，一些塑料制品包括哺乳瓶內(nèi)所溶解出的BPA也對新生兒存在著潛在的危害。子代哺乳期，是生殖系統(tǒng)發(fā)育的一個(gè)敏感時(shí)期。生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育受激素的調(diào)控，發(fā)育階段暴露于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，將破壞體內(nèi)性激素的代謝平衡，干擾支持細(xì)胞早期的快速增殖，影響生精小管的發(fā)育成熟，嚴(yán)重的可導(dǎo)致永久的，不可逆的生殖系統(tǒng)發(fā)育異常［13，14］。BPA 為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的一種，可干擾內(nèi)源性性激素正常水平的維持而影響生殖系統(tǒng)發(fā)育。呂毅等［15］研究胚胎期接觸雙酚A對雄性仔鼠的生殖功能的影響，發(fā)現(xiàn)妊娠小鼠灌服 BPA，可使仔鼠曲細(xì)精管排列紊亂，曲細(xì)精管管腔中成熟精子數(shù)減少，睪丸乳酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性改變。但目前對BPA是否干擾睪丸內(nèi)雌激素受體表達(dá)的研究還很少。本實(shí)驗(yàn)通過雄性仔鼠在哺乳期接觸BPA，在研究BPA暴露對子代雄鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響的同時(shí)，通過研究睪丸組織 ERβ的表達(dá)量變化情況，探討B(tài)PA影響睪丸發(fā)育的機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雄性仔鼠在哺乳期接觸BPA導(dǎo)致睪丸支持細(xì)胞生長被抑制，不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞的生長受到不良影響。支持細(xì)胞在睪丸中起到支持和營養(yǎng)生精細(xì)胞的作用，曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)和生精細(xì)胞形態(tài)的改變可能源自支持細(xì)胞的生長和功能受到抑制。另外在睪丸發(fā)育的過程中，雌激素對支持細(xì)胞功能的實(shí)現(xiàn)和生殖細(xì)胞附著在支持細(xì)胞上起重要作用。BPA的雌激素樣作用可能會干擾睪丸支持細(xì)胞和生精細(xì)胞的發(fā)育［16］。而雌激素的作用主要是由靶細(xì)胞上特異的胞內(nèi)受體介導(dǎo)的。在生殖系統(tǒng)中，雌激素主要通過與 ERα、ERβ結(jié)合，形成“配體-受體復(fù)合體”調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性［17］。ER上具有多個(gè)配體結(jié)合部位，某些部位可與內(nèi)源性雌激素結(jié)合，而其他部位則可與環(huán)境雌激素樣物質(zhì)相結(jié)合，環(huán)境雌激素樣物質(zhì)與ER結(jié)合后則可與雌激素發(fā)揮協(xié)同作用，激發(fā)雌激素效應(yīng)的產(chǎn)生［18］。

我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)哺乳期暴露于BPA后，子代雌激素水平升高，精子畸形率顯著升高，睪丸內(nèi)ERα表達(dá)上調(diào)［19］。除 ERα外，另外也有研究發(fā)現(xiàn)ERβ在不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞及支持細(xì)胞上也有表達(dá)［8］，說明ERβ在睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的過程中也發(fā)揮作用，影響精子的生成。BPA有雌激素樣作用，可影響生殖功能［16］，在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)哺乳期暴露于BPA導(dǎo)致了雄性仔鼠成年后睪丸組織中ERβ的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，這可能也與BPA的雌激素樣作用有關(guān)，BPA與睪丸中 ERβ結(jié)合，模擬雌激素的作用，導(dǎo)致受體激活和引發(fā)相應(yīng)的生物效應(yīng)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)低劑量組ERβ表達(dá)最高，這可能與激素和內(nèi)分泌干擾物的劑量和效應(yīng)通常呈非線性關(guān)系，而表現(xiàn)為U型或倒U型劑量效應(yīng)關(guān)系有關(guān)。但激素受體的表達(dá)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，通常受到體內(nèi)多種激素的調(diào)控，如下丘腦、垂體分泌的激素也會影響到雌激素的分泌，從而影響ER的表達(dá)。雙酚A本身也可誘導(dǎo)或抑制下丘腦、垂體等器官相應(yīng)激素的釋放［20］，本實(shí)驗(yàn)中雙酚A對睪丸發(fā)育的影響也有可能是通過干擾下丘腦、垂體的內(nèi)分泌功能而產(chǎn)生的間接影響，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

哺乳期接觸BPA對雄鼠睪丸發(fā)育有著長期的不良影響。BPA可能通過改變雌激素受體表達(dá)從而影響睪丸發(fā)育，繼而可能影響睪丸功能、精子質(zhì)量及生育功能，導(dǎo)致相關(guān)的行為學(xué)的異常。

(本文圖 1，2 見彩插 8。)

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Effects of lactational exposure to bisphenol A on the structure of testis and the expression of estrogen receptor β in adult male mouse offsprings

DING Bao-qing1，ZHANG Yi-jun1，XIE Mei-na2，LI Sha-sha1
(1.Department of Pharmacology，2.Medical Experiment Center，Weifang Medical University，Weifang Medical University，Weifang 261053，China)

Objective To study the effects of lactational exposure to bisphenol A(BPA)on the structure of testis and the expression of estrogen receptor β in adult male mouse offsprings.Methods BPA(at a dose of 100，50，or 5 mg/kg)was given daily by gastric gavage to female mice(Mus musculus)on postpartum days 2-22，and the mice offsprings were exposed to BPA by maternal milk.The pups were sacrificed on postnatal day(PND)75 and the testes were removed for pathological examination，and the expression of estrogen receptor β by was assessed by immunohistochemistry，RT-PCR and Western blot analysis.Result BPA inhibited the development of testis.The appearance of the spermatogenic cells was disordered.BPA treatment caused an up-regulation of ERβ relative expression in the testis，especially it was significantly in the low-dose group.Conclusions Lactation exposure to BPA causes morphological changes in the testis，and an up-regulation of ERβ expression in the testis of the male offsprings，leading to changes in the development of testis.

Bisphenol A;Lactation;Testis;ERβ

Q95-33，R-114

A

1005-4847(2011)02-0140-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.012

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(No.J08LG77)。

丁保清(1984-)，女，碩士研究生，研究方向：內(nèi)分泌干擾物生殖毒理研究。

張義軍，教授。Email：zhangyijun200839@sina.com

2010-10-11