譚元卿，李 薇，杜小燕，路 靜，吳艷花，王 超，陳振文

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)系，北京 100069)

種間轉(zhuǎn)移擴增法篩選長爪沙鼠微衛(wèi)星位點

譚元卿，李 薇，杜小燕，路 靜，吳艷花，王 超，陳振文

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)系，北京 100069)

目的 篩選長爪沙鼠新的微衛(wèi)星位點，為長爪沙鼠遺傳分析提供遺傳標(biāo)記物。方法 從GenBank中隨機選取小鼠微衛(wèi)星位點引物536對，用這些引物對長爪沙鼠基因組DNA擴增，將陽性目的條帶進(jìn)行序列分析，找出符合微衛(wèi)星序列特征的短串聯(lián)重復(fù)序列。結(jié)果 536對小鼠微衛(wèi)星引物在長爪沙鼠基因組中擴增出了313個陽性條帶，經(jīng)序列分析，確定130個長爪沙鼠微衛(wèi)星位點;其中完美型位點占80.77%(105/130)，不完美型位點占19.23%(25/130)，與小鼠同源性為 24.3%(130/536)。將篩選出的微衛(wèi)星位點在 GenBank中注冊，注冊號從GU562694到GU562823。結(jié)論 小鼠和沙鼠的微衛(wèi)星位點具有較高的同源性，用小鼠的微衛(wèi)星位點引物直接擴增長爪沙鼠基因組DNA可有效地篩選出長爪沙鼠微衛(wèi)星位點。

小鼠;長爪沙鼠;微衛(wèi)星;種間轉(zhuǎn)移擴增

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級長爪沙鼠22只，性別不限，體質(zhì)量49～85 g，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供【SCXK(京)2000-0012】，用于提取基因組DNA。

1.1.2 儀器：瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一儀器廠);3K18高速冷凍離心機(Sigma公司，USA);超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司);PCR儀(PTC-200 Peltier Thermal cycle，Bio-Rad公司，USA)。

1.1.3 試劑：蛋白酶 K(Merck公司產(chǎn)品);低熔點瓊脂糖(Promega公司產(chǎn)品);50bp DNA step ladder marker、Taq DNA聚合酶及 dNTP(大連寶生物工程有限公司，中國);克隆測序由北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 方法

1.2.1 微衛(wèi)星的篩選：從GenBank中隨機挑選536個小鼠的微衛(wèi)星位點引物序列進(jìn)行合成，這些位點隨機地分布于小鼠的常染色體和X染色體。

1.2.2 樣本DNA的準(zhǔn)備：稱取0.1 g腎臟組織，剪碎放入盛有2 mL STE緩沖液的離心管中，然后加入蛋白酶 K(0.02 mg/mL)，55℃水浴消化12 h。隨后采用酚-氯仿萃取法提取 DNA，用無水冰乙醇沉淀，空氣中干燥后用TE液溶解。DNA濃度用分光光度計(Bio-Rad 680，USA)測定，并進(jìn)一步用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR 擴增：反應(yīng)體系為 30 μL，其中：10 ×buffer 3.0 μL;Mg2+濃度分別設(shè)置為 3.5、3.0、2.5、2.0 和 1.5 mmol/L;10 mmol/L dNTP 1.5 μL;10 μmol/L 上、下游引物各 1.5 μL;樣品 DNA 1.8 μL(約60 ng);5U的 Taq酶 0.3 μL;用超純水將體系補到30 μL。擴增條件：①預(yù)變性95℃ 5 min;②變性94℃ 30 s;③退火溫度梯度：47～60℃ 30 s，④延伸72℃ 30 s;② ～④35個循環(huán);⑤最后 72℃延伸7 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物處理： 取少量產(chǎn)物加樣于1.5%的瓊脂糖凝膠(加有適量的EB替代物)中電泳，挑選擴增產(chǎn)物在80～700 bp之間的條帶測序，根據(jù)文獻(xiàn)定義［6］確定是否為微衛(wèi)星位點并進(jìn)行歸類分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增和序列分析

隨機挑選的536對小鼠的微衛(wèi)星位點引物，通過對22只沙鼠基因組DNA進(jìn)行PCR擴增得到313(58.39%)個陽性條帶(圖1)。對這313個PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行序列分析后，篩選到了130個符合微衛(wèi)星條件(圖2)的長爪沙鼠微衛(wèi)星位點。將這些位點在GenBank上注冊，相應(yīng)的注冊號見表1。從這些位點的類型分析中發(fā)現(xiàn)，有105個微衛(wèi)星位點屬于完美型位點，占80.77%;其他類型位點為25個，占19.23%。在130個長爪沙鼠微衛(wèi)星位點中，有69個位點的等位基因大小為200～300 bp，占53.1%(表 2)。

2.2 長爪沙鼠微衛(wèi)星位點的類型分析

將這130個位點的重復(fù)單位進(jìn)行了歸類分析結(jié)果表明：在單核苷酸重復(fù)的29個位點中，(A)n有14個，(T)n占13個，(A)n和(T)n之和占93.1%(27/29);二核苷酸的微衛(wèi)星數(shù)量是39個，占所有類型的30%(39/130)，主要以(AC)n和(CA)n為主，其余見表3。

3 討論

由于微衛(wèi)星在基因組中廣泛分布，具有良好的特異性和易于檢測，使其成為生物遺傳圖譜的構(gòu)建、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、物種遺傳多樣性的鑒定、個體識別等方面研究的重要遺傳標(biāo)記之一。常見的微衛(wèi)星位點獲得方法包括：1、從公共數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星位點;2、從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點;3、遺傳距離相近的物種間引物轉(zhuǎn)移擴增。在上述的三種方法中，最簡單省時的方法是從各個數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星位點。如：Liu等［7］從大麥基因組文庫中篩選了45個微衛(wèi)星標(biāo)記，并在大麥染色體上作圖;Cho［8］從水稻基因組中查到194個微衛(wèi)星標(biāo)記。但該方法僅限于已有序列數(shù)據(jù)發(fā)布的物種。絕大多數(shù)微衛(wèi)星位點是從小于1000bp的小插入片段基因組文庫中通過寡核苷酸探針雜交獲得的，魏東旺［9］從鯉魚基因組 DNA中篩選微衛(wèi)星位點時，用探針(CA)n對構(gòu)建的文庫雜交篩選，得到了22個微衛(wèi)星位點。但該方法效率很低，為了提高微衛(wèi)星位點分離的效率，研究者們常常采用引物法富集微衛(wèi)星、雜交法富集微衛(wèi)星以及RAPD富集法等篩選微衛(wèi)星。富集法需要昂貴的實驗設(shè)備來進(jìn)行雜交檢測，同時需要花費較多的研究經(jīng)費，這些在一定程度上限制了其使用。由于微衛(wèi)星側(cè)翼序列在物種間具有保守性，所以一個物種的微衛(wèi)星引物可以用來檢測相近物種同源位點的多態(tài)性。Roy等［1］用狗的微衛(wèi)星引物研究狼的遺傳分化和雜交;Primmer和 Ellegren［11］描述了微衛(wèi)星在6億年前就分開的兩個鳥類中的保守性;家牛和馬的微衛(wèi)星引物也分別被用來研究非洲水牛和加泰羅尼亞驢的遺傳變化和種群結(jié)構(gòu)［12，13］。

用種間引物轉(zhuǎn)移擴增方法來篩選物種新的微衛(wèi)星位點，常常需要改變擴增條件來實現(xiàn)其在物種間的通用性，甚至用測序和雜交等方法來進(jìn)一步確定是否是微衛(wèi)星，如趙太云等［14］用該方法在小鼠和長爪沙鼠間進(jìn)行了初步嘗試，通過優(yōu)化擴增條件的方法用小鼠的微衛(wèi)星引物在長爪沙鼠基因組DNA中篩選到了陽性條帶，但遺憾的是沒有進(jìn)行序列分析，尚不能確定為微衛(wèi)星位點。

圖1 小鼠微衛(wèi)星位點D3Mit130的引物在沙鼠中PCR擴增結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification in the gerbil genome by mouse primers of loci D3Mit130

圖2 小鼠位點D3Mit268的引物在沙鼠基因組DNA上PCR擴增產(chǎn)物的測序圖Fig.2 The sequence map of discrete PCR products of the gerbil genome generated at the loci D3Mit268 by mouse-derived primers

表2 新篩選的長爪沙鼠微衛(wèi)星位點的類型及產(chǎn)物大小Tab.2 Classes and product size of the new screened gerbil microsatellite loci

我們用小鼠的536微衛(wèi)星位點，在沙鼠的基因組上成功的擴增出313條帶，經(jīng)測序得到了130個微衛(wèi)星位點的序列，其陽性率為24.3%。但與其他報道相比，陽性率較低，例如 deGortari等［15］在 1997年用牛族位點引物在綿羊基因組上的擴增陽性率為58%(605/1036)，Huang 等［16］在 2005 年用鴨的微衛(wèi)星位點在鵝的基因組上擴增也得到了50%(14/28)的陽性率，究其原因可能有以下幾個方面：①公司測序時，有些條帶在克隆或測序時出現(xiàn)了失誤，而導(dǎo)致確定微衛(wèi)星位點時比實際數(shù)量偏少;②同時在300 bp以上的條帶中，經(jīng)常有幾種類型的核心序列，如按照混合型的位點計算，則與混合型微衛(wèi)星位點的要求不符，但按兩個位點來設(shè)計引物就是微衛(wèi)星位點;③上面提到的其他物種篩選微衛(wèi)星位點都是在同一屬的不同種動物間篩選，它們之間有很近的親緣關(guān)系。而小鼠與沙鼠只是屬于同科，遺傳分類上分屬不同的種屬，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因而同源性相對較低。

通過536個位點引物的PCR擴增，經(jīng)測序確定了130個簡單序列重復(fù)位點，其中完美型的位點為105個(80.77%)，有69個位點的大小在200～300 bp之間。這些位點為長爪沙鼠基因組的遺傳分析和生物學(xué)特性基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)，特別是為構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，生物的多樣性分析、基因漂流以及親緣關(guān)系等方面研究提供了有力工具;也為我們今后將要開展的長爪沙鼠腦缺血模型群體的培育及相關(guān)性狀的QTL研究提供了工具。從本實驗結(jié)果可以看出，用小鼠的微衛(wèi)星位點引物對長爪沙鼠的基因組進(jìn)行 PCR擴增，篩選微衛(wèi)星位點是一種有效途徑。

表3 長爪沙鼠微衛(wèi)星位點重復(fù)單位核苷酸類型Tab.3 The type of nucleotide repeats of gerbil loci

［1］ Bartoszyk GD，Hamer M.The genetic animal model of reflex epilepsy in the Mongolian gerbil：differential efficacy of new anticonvulsive drugs and prototype antiepileptics［J］.Pharmacol Res Commun，1987，19(6)：429-440.

［2］ Hidiroglou N，Gilani GS，Long L，et al.The influence of dietary vitamin E，fat，and methionine on blood cholesterol profile homocysteine levels，and oxidizability of low density lipoprotein in the gerbil［J］.Nutr Biochem，2004，15(12)：730-740.

［3］ 崔美芝，劉恩重，柳英俠.長爪沙鼠在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用［J］. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1996，32(2)：205-206.

［4］ 李志東，劉忠華，陳美才，等.小鼠、大鼠、豚鼠和沙鼠對禽流感病毒致病敏感性的比較初報［J］.中國實驗動物學(xué)報，2004，12(4)：212-216.

［5 ］ Neumann K，Maak S，Stuenner IW，et al.Low microsatellite variation in laboratory gerbils［J］.J Hered，2001，92(1)：71-74.

［6］ Chambers GK，MacAvoy ES.Microsatellites：consensus and controversy［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol.2000，126(4)：455-476.

［7］ Lui ZW，Biyashev RM，Saghai Maroof MA.Development of simple sequence repeats DNA markers and their integration into a hardly linkage map［J］，Theor Appl Genet，1996，93：869-876.

［8］ Cho YG，Iahii T.Diversity of microsallite derived from genetic libraries and Genbank sequence in rice(Oryza sativa L)［J］.Theore Appl Genet，2000，100：713-722.

［9］ 魏東旺，樓允東，孫效文，等.鯉魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選［J］. 動物學(xué)研究，2001，22(3)：238-241.

［10］ Roy M S，Geffen E.Pattern of differentiation and hybridization in North American wolflike canids，recalled by analysis of microsatellite loci［J］.Mol Biol Evolution，1994，11：553-570.

［11］ Primmer C R，Ellegren H.Patterns of molecular evolution in avain microsatellites［J］，Mol Biol Evolution，1998，15：997-1008.

［12］ Simonsen BT，Siegimund HR，Arctander P.Population structure of African buffalo inferred from mtDNA sequences and microsatellite loci： high variation but low differentiation［J］.Mol Ecol，1998，7：225-237.

［13］ Jordana J，F(xiàn)olch P，Sanchez A，.Genetic variation(protein markers and microsatellites)in endangered Catalonian donkeys［J］.Biochem Syst Ecol，1999，27：791-798.

［14］ 趙太云，路 靜，陳振文，等.大、小鼠微衛(wèi)星引物對長爪沙鼠的擴增［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(2)：114-117.

［15］ deGortari MJ，F(xiàn)reking BA，Kappes SM，et al.Extensive genomic conservation of cattle microsatellite heterozygosity in sheep［J］.Anim Genet.1997，28：274-290.

［16］ Huang YH，Tu JF，Cheng XB，et al.Characterization of 35 novel microsatellite DNA markers from the duck(Anas platyrhynchos)genome and cross-amplification in other birds［J］.Genet Select Evol.2005，37：455-472.

Screening of novel microsatellite DNA markers in Mongolian gerbils by cross-amplification

TAN Yuan-qing，LI Wei，DU Xiao-yan，LU Jing，WU Yan-hua，WANG Chao，CHEN Zhen-wen*
(Department of Laboratory Animal Sciences，Capital Medical University，Beijing 100069，China)

Objective To screen new microsatellite loci in Mongolian gerbils to develop genetic markers for genetic analysis.Methods 536 mouse loci were randomly selected from GenBank and amplified in Mongolian gerbils genetic DNA.The positive PCR products were sequenced and confirmed as simple sequence repeat(SSR)loci.Result Of these 536 mouse markers，313(58.39%)were discretely amplified from the laboratory gerbils.Of these 313 sequenced markers，130 were confirmed as SSR loci in the gerbil，in which 105 loci(80.77%)were classified as pure，and 25 loci(19.23%)as unpure.The homology orthologous between mouse and gerbil is about 24.3%(130/536)，and the access number of loci in GenBank is from GU562694 to GU562823.Conclusions There are comparatively high homology between mouse and gerbil，and cross-amplification by mouse microsatellite primers is an efficient way to identify gerbil SSR loci.

Mouse;Mongolian gerbil;Microsatellite;Cross-amplification

Q95-33

A

1005-4847(2011)01-0001-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.001

長爪沙鼠被譽為“多能性”實驗動物，在生命科學(xué)諸多領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用［1-4］。但由于對長爪沙鼠的基礎(chǔ)研究相對薄弱，尤其是遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究開展的甚少，致使對長爪沙鼠生物學(xué)特性及應(yīng)用研究不夠深入。找到更多的遺傳標(biāo)記物是開展長爪沙鼠遺傳研究的基礎(chǔ)和條件，而微衛(wèi)星由于在基因組中分布廣泛、信息含量大、結(jié)果穩(wěn)定可靠、易于鑒定及簡單的遺傳方式等特點，使其成為一種極好的分子標(biāo)記體系，應(yīng)用其對個體基因組分析后，可以得到豐富的多態(tài)性信息和數(shù)據(jù)，目前已廣泛地應(yīng)用于各種生物的基因定位、連鎖分析，群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和標(biāo)記輔助選擇等方面的研究。但長爪沙鼠的微衛(wèi)星位點報道較少，僅有Neumann等［5］在2001年篩選的9個微衛(wèi)星位點。根據(jù)微衛(wèi)星引物在不同種動物間有保守性原理，我們采用了種間轉(zhuǎn)移擴增法——用小鼠的微衛(wèi)星引物篩選長爪沙鼠微衛(wèi)星位點，為建立長爪沙鼠微衛(wèi)星位點遺傳數(shù)據(jù)庫積累數(shù)據(jù)。

國家自然科學(xué)基金項目(No.30570261);國家科技支撐計劃課題(No.2009BAI83B02);北京市教委重點項目(No.KZ200910025002)。

譚元卿，(1983-)，男，碩士研究生，研究方向：實驗動物分子遺傳學(xué)。

陳振文(1959-)，男，博士，教授，主要從事實驗動物教學(xué)與科研工作。Email：czwen@sohu.com

2010-10-12