張倩倩，劉守金，俞年軍，方成武

(安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實驗室，安徽 合肥 230031)

栽 培

利用細(xì)莖石斛種子胚繁育試管苗的不同培養(yǎng)基研究△

張倩倩，劉守金*，俞年軍，方成武

(安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實驗室，安徽 合肥 230031)

目的：建立細(xì)莖石斛Dendrobiummoniliforme(L.)Sw.種子胚的組織培養(yǎng)和快速繁殖方法。方法：在相同的培養(yǎng)條件下，種子胚接種于8種不同培養(yǎng)基上，選擇長勢相近的試管苗轉(zhuǎn)接于添加不同濃度激素的1/2 MS培養(yǎng)基上，對不同生長狀況的試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計和分析。結(jié)果：比較適合誘導(dǎo)細(xì)莖石斛種子萌發(fā)的培養(yǎng)基是1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA，生根的培養(yǎng)基是1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA，壯苗的培養(yǎng)基1/2 MS+1.2 mg·L-1IBA。結(jié)論：適合的培養(yǎng)基對細(xì)莖石斛種子胚的生長發(fā)育結(jié)果有很大差異。

細(xì)莖石斛；組織培養(yǎng)；種子胚

細(xì)莖石斛Dendrobiummoniliforme(L .)Sw.又名銅皮石斛，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，以莖入藥，性寒，味甘，具有滋陰清熱、益胃生津、消炎止痛、增強(qiáng)免疫力等功效，歷來作為石斛品種來源之一。石斛屬植物主要分布于我國西南地區(qū)，大別山區(qū)是該屬植物的分布北緣，也是藥用優(yōu)質(zhì)石斛的主要分布區(qū)域，細(xì)莖石斛是安徽大別山區(qū)野生變家種的品種之一。由于該種的生長與繁殖對環(huán)境要求嚴(yán)格，種子缺乏胚乳組織，僅有幾個細(xì)胞的不成熟胚，自然條件下萌發(fā)率極低[1]，加上環(huán)境的破壞和人們對野生資源的掠奪性采挖，導(dǎo)致資源的嚴(yán)重匱乏。目前石斛的低繁殖率是制約規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵問題。該屬植物通過組織培養(yǎng)進(jìn)行繁殖有許多研究[2]，細(xì)莖石斛以莖段為外植體、種子通過組織培養(yǎng)進(jìn)行繁殖研究較少[3-5]。本試驗在已有的研究基礎(chǔ)上，對安徽霍山產(chǎn)的細(xì)莖石斛種子胚萌發(fā)及生根壯苗的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)基篩選研究，優(yōu)化培養(yǎng)條件，為細(xì)葉石斛的規(guī)模化生產(chǎn)提供組培苗方面的研究試驗探索。

1 材料

細(xì)莖石斛的果實于2009年12月采自安徽霍山縣太平畈鄉(xiāng)，原植物經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院劉守金教授鑒定為蘭科植物細(xì)莖石斛Dendrobiummoniliforme(L .)Sw.，憑證標(biāo)本ZH001存于安徽中醫(yī)學(xué)院標(biāo)本館(ACM)。

2 方法

2.1 種子胚萌發(fā)培養(yǎng)

將細(xì)莖石斛的果實沖洗干凈，置0.1 %升汞試液中表面消毒8 min，無菌水沖洗3次，再用75 %乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3次；用無菌鑷子撕開果皮，輕輕抖動，把種子散落到加入無菌水的小燒杯中，使種子呈懸浮狀態(tài)；用吸管吸取懸浮液，分別接種在1/2 MS、1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA、MS、MS+1.0 mg·L-1NAA、KC、KC+1 mg·L-1NAA、B5、B5+1.0 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基各10瓶，觀察100 d記錄。

2.2 生根壯苗培養(yǎng)

從細(xì)莖石斛種子胚培養(yǎng)出的幼苗中，選取高度、長勢相近，沒有生根的幼苗轉(zhuǎn)接到1/2 MS培養(yǎng)基中，分別加激素NAA濃度為0.5，1.0，1.5，2.0 mg·L-1；激素IBA濃度為0.1，0.4，0.8，1.2 mg·L-1的培養(yǎng)基上，每種10瓶，每瓶接種6個小苗，觀察90 d記錄。

2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度25 ℃，前5 d為暗培養(yǎng)，后期光照強(qiáng)度2 500 lx，光照時間10 h·d-1，濕度75 %。

2.4 觀察記錄項目

觀察種子萌發(fā)情況和在不同培養(yǎng)基上試管苗的長勢情況，包括轉(zhuǎn)綠時間、原球莖形成時間、形態(tài)分化時間、形成叢生芽的形態(tài)、平均苗高、苗壯度、葉色、葉長；平均根長、根數(shù)、根長勢、平均株高、叢生苗數(shù)、葉長/寬、葉色、健壯度。

3 結(jié)果

3.1 不同培養(yǎng)基配方對細(xì)莖石斛種子胚的萌發(fā)和原球莖分化的影響

組織培養(yǎng)18 d后，1/2 MS+NAA培養(yǎng)基中種子胚最先轉(zhuǎn)綠，1/2 MS、MS、MS+NAA、KC、KC+NAA、B5+NAA培養(yǎng)基中種子胚陸續(xù)轉(zhuǎn)綠，并逐漸膨大，B5培養(yǎng)基中種子未見萌發(fā)轉(zhuǎn)綠，見表1。

35 d后，1/2 MS+NAA培養(yǎng)基中形成原球莖，單個原球莖呈小圓錐狀，或多個呈桑椹狀，單個原球莖直徑達(dá)到0.6～0.8 cm。原球莖頂端有鱗片狀的葉原基突起，呈深綠色；MS、MS+NAA培養(yǎng)基中原球莖較小，直徑最大達(dá)到0.4 cm，呈淡黃綠色。KC+NAA、KC培養(yǎng)基中原球莖直徑最大達(dá)到0.5 cm，呈翠綠色。B5+NAA培養(yǎng)基中原球莖小，直徑僅有0.2 cm。B5培養(yǎng)基中未形成原球莖，見表1。

45 d后，1/2 MS+NAA培養(yǎng)基中原球莖大量分化，形成莖、芽，均粗壯，葉片多，顏色深，葉最長約1.0 cm，苗最高達(dá)到1.2 cm，長勢很好。KC和KC+NAA培養(yǎng)基中，苗大量叢生，成簇狀，但苗比1/2 MS和1/2 MS+NAA細(xì)小。MS、KC培養(yǎng)基中原球莖沒有分化，見表2。

表1 不同培養(yǎng)基對細(xì)莖石斛原球莖形成的影響

表2 不同培養(yǎng)基對細(xì)莖石斛幼苗發(fā)育的影響

注：+-不發(fā)達(dá)；++ - 一般發(fā)達(dá)；+++ -較發(fā)達(dá)；++++ -最發(fā)達(dá)

3.2 不同濃度的IBA激素對細(xì)莖石斛壯苗的影響

觀察1/2 MS培養(yǎng)基中，加濃度分別為0.1，0.4，0.8，1.2 mg·L-1的激素IBA，平均株高、葉片長度/寬度逐漸增加，葉片顏色逐漸變深，苗逐漸粗壯。平均根長逐漸增長、根數(shù)增多，根由細(xì)、小長為粗、長。當(dāng)IBA激素濃度達(dá)到1.2 mg·L-1時，苗最健壯，見表3。

表3 不同濃度的IBA激素對細(xì)莖石斛壯苗的影響

注：+-不發(fā)達(dá)；++ - 一般發(fā)達(dá)；+++ -較發(fā)達(dá)；++++ -最發(fā)達(dá)

3.3 不同濃度的NAA激素對細(xì)莖石斛生根的影響

在1/2 MS培養(yǎng)基中添加不同濃度NAA組中，濃度為0.5 mg·L-1和1.5 mg·L-1的兩組植株均白化死亡。由表4觀察出，濃度為1.0 mg·L-1時，生根率達(dá)到了100 %，根長、粗、壯，并且叢生苗多，葉大、色深，苗長勢健壯。濃度為2.0 mg·L-1時，平均根長達(dá)到了1.2 cm，生根率為80 %，根粗、壯。叢生苗達(dá)到3個，葉大，但有很多黃葉。

表4 不同濃度的NAA激素對細(xì)莖石斛生根的影響

注：++ -一般發(fā)達(dá)；+++ -較發(fā)達(dá)

4 結(jié)論與討論

通過8種不同培養(yǎng)基對細(xì)莖石斛種子萌發(fā)和分化影響的比較研究，結(jié)果表明,在1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA培養(yǎng)基，種子胚培養(yǎng)約18 d種子開始變綠，并逐漸膨大；培養(yǎng)35 d后觀察，由種子形成的原球莖比較均勻，直徑在0.6～0.8 cm。其后原球莖上端開始有芽形成，45 d后觀察幼苗形成。1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA培養(yǎng)基對細(xì)莖石斛的原球莖形成、分化時間最短，幼苗平均高達(dá)到了1.2 cm，莖粗、壯，葉最長1 cm，葉片多，顏色深，長勢最好。在KC+NAA培養(yǎng)基組中，種子胚通過培養(yǎng)產(chǎn)生大量簇生的幼苗，但苗較1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA培養(yǎng)基萌發(fā)的苗細(xì)小。試驗結(jié)果提示在同類培養(yǎng)基中，添加NAA激素組的種子萌發(fā)情況均好于不添加激素組。MS、B5和B5+NAA培養(yǎng)基均不適合細(xì)莖石斛的種子萌發(fā)。

在比較1/2 MS培養(yǎng)基中添加不同濃度IBA對生根的影響中，當(dāng)激素IBA濃度為1.2 mg·L-1時，苗的長勢相對較好，生根率達(dá)到80 %，平均根數(shù)及平均根長均最好，1/2 MS +1.2 mg·L-1IBA是壯苗和生根的最適培養(yǎng)基。

[1] 張明，夏鴻西，朱利泉，等.石斛組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2000，25，(6)：323-326.

[2] 明興加，馮婷婷.中國石斛屬植物種苗繁育技術(shù)的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,38(6)：2899-2902，2920.

[3] Choi SK, Lee DK. The study on the artificial propagation ofDendrogiummoniliformein wild medicinal herb[J]. The Research Reports of the Rural Development Administration,1989, 31(3): 52-56.

[4] 王再花,涂紅艷,葉慶生.細(xì)莖石斛的快速繁殖和試管開花誘導(dǎo)[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(6)：1143-1144.

[5] 田雪琪,張鐵.細(xì)莖石斛組織培養(yǎng)研究[J].文山師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報,2007,20(3)：114-116.

TissueCulturingandRapidPropagationofDendrobiummoniliforme(L.)Sw.

ZHANG Qian-qian, LIU Shou-jin, YU Nian-jun, FANG Cheng-wu

(SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,AnhuiKeyLaboratoryofModernTraditionalChineseMedicine,Hefei, 230031,China)

Objective:To established the optimal medium and culture condition for in vitro culture and rapid propagation of embryo ofD.moniliforme.Methods: The embryo was inoculated and cultivated in 8 different kinds of culture medias under the same culture condition.The same length of seeding was inoculated in 1/2 MS solid medium with different concentrations of hormones (NNA and IBA).Results:1/2 MS containing 1.0 mg·L-1NAA is the best media for embryo germination,and 1/2 MS containing 1.0 mg·L-1NAA is the best media for the developing of roots;and 1/2 MS containing 1.2 mg·L-1IBA is the best media for plantlet strengthening.Conclusion: Tissue culture is effective way in the rapid propagation for large-scale production ofD.moniliforme.

Dendrobiummoniliforme; Tissue culture; Embryo.

安徽省自然基金項目(090413110)，安徽省高校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項目(KJ2010A203)

*劉守金，Tel：(0551)5169306,E-mail：liushjin@hotmail.com

2010-12-09)