劉琳琪，黎成勇，黃永平

（長沙學(xué)院 生物工程與環(huán)境科學(xué)系，湖南 長沙410003）

分析測試

高效液相色譜法測定乳粉中苯甲酸含量的不確定度評定

劉琳琪，黎成勇，黃永平

（長沙學(xué)院 生物工程與環(huán)境科學(xué)系，湖南 長沙410003）

依據(jù)JJF1059-1999《測量不確定度評定與表示》的原理與方法，建立了液相色譜法測定乳粉中苯甲酸含量的測量不確定度評定的數(shù)學(xué)模型，并對測試過程中不確定度分量的來源進(jìn)行了分析、量化和合成。結(jié)果表明：最終結(jié)果的不確定度主要由樣品處理過程產(chǎn)生的不確定度引起。

液相色譜；乳粉；苯甲酸；不確定度評定

Abstract:Based on JJF1059-1999 Evaluation of the Uncertainty of Determination and Expression,a mathematicalmodel was established to assess the uncertainty of analyzing benzoic acid in milk powder by HPLC.Factors thatwere contributing to the uncertainty were analyzed,quantified and synthesized.The results showed that the uncertainty of this experiment ismainly caused by the treatmentof sample.

Key words:liquid chromatography；milk powder；benzoic acid；uncertainty evaluation

苯甲酸是一種廣泛使用的食品防腐劑，依據(jù)GB2760-2007規(guī)定，可應(yīng)用于果脯、蜜餞、調(diào)味料、腌制蔬菜、果汁飲料、果酒等食品中，不允許在乳制品中添加[1]。但是，乳中本身含有苯甲酸。根據(jù)消費(fèi)者對乳制品中苯甲酸的關(guān)注，以及對乳制品安全風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的需要，新的乳制品標(biāo)準(zhǔn)正在修訂中，根據(jù)專家的建議，已將苯甲酸含量列為產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)之一，并規(guī)定了允許檢出的最高限量值。為了在測量結(jié)果的表達(dá)和質(zhì)量評定等方面更為準(zhǔn)確，本實(shí)驗(yàn)參照GB/T21703-2008《乳與乳制品中苯甲酸和山梨酸的測定》中檢測方法[2]，根據(jù)JJF1059-1999《測量不確定度評定與表示》對乳粉中苯甲酸含量的不確定度進(jìn)行了測量和評定[3]，以期為評定測量結(jié)果質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 測量方法

1.1 儀器與試劑

1200高效液相色譜儀（安捷倫公司）。

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品（sigma公司）；甲醇（色譜純），水（超純水）；其他試劑均為分析純。

1.2 試樣處理

準(zhǔn)確稱取3g樣品，加10mL水溶解，再加入0.1mol·L-1NaOH溶液25mL于超聲波水浴中處理15min。用 0.5mol·L-1H2SO4pH 值到 8，加入 92g·L-1的亞鐵氰化鉀和183g·L-1的乙酸鋅溶液各2mL，劇烈振搖后定容到100mL，靜置15min，上清液過濾膜用于高效液相色譜分析。

1.3 色譜條件

色譜柱為AgilentXDBC18色譜柱（4.6250mm）；流動(dòng)相為甲醇：磷酸鹽緩沖溶液（pH值為6.7）=1∶9；流速 1.2mL·min-1；檢測波長 227nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量10μL。

2 數(shù)學(xué)模型

式中 X：樣品中苯甲酸的含量，mg·kg-1；As：樣品溶液中苯甲酸的響應(yīng)值（峰面積）；Ar：標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)定量檢測公式：值（峰面積）；C：標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，μg·mL-1；V：樣品溶液定容體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g；frec：回收率校正因子，為回收率的倒數(shù)。

從檢測過程和數(shù)學(xué)模型分析，本實(shí)驗(yàn)的測量不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、樣品溶液的響應(yīng)值、標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值、樣品稱量、定容體積、回收率等幾個(gè)方面[4]。

3 不確定度分量的來源及其量化

3.1 試樣稱量的不確定度Urel(m)

3.1.1天平的不確定度Urel（m1）天平校準(zhǔn)證書給出的在95%置信水平時(shí)，Up＝0.3mg，按照正態(tài)分布考慮評定其標(biāo)準(zhǔn)不確定度U（m1）。查表得，當(dāng)置信水平p＝95%時(shí)，kp＝1.96。

3.1.2 天平重復(fù)稱樣引起的不確定度 用砝碼在該天平上9次重復(fù)測定，極差為R＝0.1mg，用極差法計(jì)算 U（m2），查表得 C＝2.97。

3.1.3 試樣稱量的相對不確定度合成

上述兩項(xiàng)合成得出稱量的不確定度為：

本實(shí)驗(yàn)中稱樣量為3g，相對不確定度Urel（m）=U（m）/m=0.1535/3000=5.1210-5

3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度Urel（c）

3.2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度Urel（std）

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購自sigma公司，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書不確定度為1%，k=2，其相對不確定度為：Urel（std）=1%/2=0.005。

3.3 試樣處理定容體積的不確定度Urel（V）

3.4 樣品溶液響應(yīng)值的不確定度Urel（As）

標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值的不確定度包括色譜儀的測量線性和色譜測量重復(fù)性。

（1）因?yàn)闇y量時(shí)結(jié)果均在色譜儀的測量線性范圍內(nèi)，所以色譜儀的測量線性產(chǎn)生的不確定度可忽略。

（2）色譜測量重復(fù)性包括進(jìn)樣系統(tǒng)引入的不確定度、檢測器引入的不確定度和儀器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)引入的不確定度。色譜測量重復(fù)性可用重復(fù)進(jìn)樣來評定，該不確定度屬于A類評定。將處理好的樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣9次，所得測量峰面積為：114.3、113.3、114.0、114.6、113.8、113.6、115.1、113.8、114.9。以平均值的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差s（xˉ）作為測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

3.5標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值的不確定度Urel（Ar）

按照3.4同法分析，將標(biāo)準(zhǔn)工作液連續(xù)進(jìn)樣9次，所得測量峰面積為：99.3、101.2、100.4、99.8、99.5、100.1、101.7、100.5、101.4。標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

3.6回收率因子的不確定度Urel（frec）

回收率是在樣品處理過程中產(chǎn)生的，主要由樣品均一性、溶液轉(zhuǎn)移、提取效率、制備過程復(fù)雜程度等因素引入。本實(shí)驗(yàn)采用添加苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)高、中、低3個(gè)水平，每個(gè)水平平行測定3次，9次添加回收率的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，其回收率結(jié)果見表1。按照標(biāo)準(zhǔn)不確定度的A類評定，以平均值的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差作為s（xˉ）測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

表1 回收率測定結(jié)果Tab.1 Determination results for recovery

同時(shí)，對平均回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（t檢驗(yàn)），當(dāng)檢驗(yàn)值 t大于或等于 t（0.05/2，8）=2.306 時(shí)，說明有顯著性差異，計(jì)算公式中需采用frec以修正結(jié)果；當(dāng)檢驗(yàn)值 t小于 t（0.05/2，8）時(shí)，說明無顯著性差異，計(jì)算公式中不必采用frec以修正結(jié)果。計(jì)算結(jié)果如下：

t值大于臨界值t(0.05/2，8)=2.306，說明有顯著性差異，計(jì)算公式中需采用frec以修正結(jié)果。

4 不確定度的合成和擴(kuò)展

4.1 合成相對不確定度根據(jù)2中給出的數(shù)學(xué)模型，將以上各相對不確定度分量合成：

4.2 擴(kuò)展不確定度

合成不確定度U（X）=Urel（X）×X=0.0154×31.4=0.48mg·kg-1，其中 31.4mg·kg-1為本實(shí)驗(yàn)測得實(shí)際乳粉樣品的苯甲酸含量平均值。取包含因子k＝2，則擴(kuò)展不確定度為：

5 測量不確定度報(bào)告

按照GB/T 21703-2008《乳與乳制品中苯甲酸和山梨酸的測定》測定乳粉中苯甲酸含量結(jié)果為：X=31.4±0.96mg·kg-1。

6 結(jié)論

綜上所述，最終結(jié)果的不確定度主要由樣品處理過程產(chǎn)生的不確定度引起，其他分量引起的不確定度與樣品處理過程產(chǎn)生的不確定度相比較小，可忽略不計(jì)。在實(shí)驗(yàn)中，可以通過規(guī)范樣品處理過程中的操作和提高提取效率，進(jìn)一步提高回收率和減小測量結(jié)果的不確定度。

［1］GB 2760-2007食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［2］GB/T 21703-2008乳與乳制品中苯甲酸和山梨酸的測定［S］.

［3］JJF 1059-1999測量不確定度評定與表示［S］.

［4］JJF 1135-2005化學(xué)分析測量不確定度評定［S］.

［5］JJG 196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程［S］.

Uncertainty evaluation for the determ ination of benzoic acid in m ilk powder by HPLC

LIU Lin-qi，LI C heng-yong，HUANG Y ong-ping（College of Bioengineering and Environmental Engineering,Changsha University,Changsha 410003，China）

O657.37

A

1002-1124（2011）01-0024-03

2010-10-22

劉琳琪（1982-），女，碩士，助教，從事化學(xué)分析教學(xué)工作。