付明翠，文 頌，盧 瞳，柳東芳，周官輝，安艷麗，廖 蕾，居勝紅，滕皋軍

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)及其相關(guān)心腦血管疾病是西方發(fā)達國家患者死亡和致殘的首位原因[1]。在我國，近年來AS的發(fā)病率也有明顯增加的趨勢。最新的研究表明，急性心腦血管事件(腦卒中、短暫性腦缺血發(fā)作、急性冠脈綜合征) 主要是由于動脈粥樣硬化內(nèi)的易損性斑塊引起的[2]，而與血管狹窄程度無直接關(guān)系[3]。傳統(tǒng)影像技術(shù)在診斷動脈粥樣硬化斑塊時，只能顯示斑塊所造成的血管狹窄程度，并不能有效地反映斑塊的病理生理學性質(zhì)和穩(wěn)定性。近年來，分子影像技術(shù)作為易損斑塊早期檢測的一種新策略，引起心血管病研究者的重視[4,5]。

氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)在動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展以及不穩(wěn)定斑塊進展中發(fā)揮了重要的作用[6,7]。本研究以oxLDL作為MR分子影像成像靶點，構(gòu)建anti-oxLDL-USPIO靶向分子探針，采用7.0 T micro-MR 成像檢測apoE-/-小鼠頸動脈粥樣斑塊中oxLDL的動態(tài)變化，建立動脈粥樣硬化斑塊形成中的特異性評價體系，并為下一步探討他汀類藥物治療AS 的作用機制和療效評價提供一個新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料

超微超順磁氧化鐵粒子(聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG)包被USPIO，表面攜帶羧基活性基團，由中國科學院化學所惠贈[8,9])，兔抗小鼠anti-oxLDL多克隆抗體(北京博奧森公司)，非特異性小鼠IgG抗體(北京博奧森公司)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)和Sulfo-NHS均為上海共價化學公司產(chǎn)品，硼酸(江蘇永華精細化學品有限公司)，十水合四硼酸鈉(西隴化工股份有限公司)，微量震蕩器(上海亞榮生化儀器廠)，高速冰凍離心機(eppendorf centrifuge 5804R)，透射電子顯微鏡(TEM,JEM-200CX, 日本JEOL 公司)，動態(tài)光散射檢測(90 Plus ParticleSize Analyzer, Brookha-ven公司)，超濾離心管(100KD, Millipore公司產(chǎn)品)，7.0 T micro-MR成像儀(德國Bruker公司)，冰凍切片機(CMI950，Leica)，SP免疫組化試劑盒 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色劑(福建邁新公司)，倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 探針構(gòu)建及特征檢測

取1mg PEG包被的USPIO溶于PH9的硼酸/硼酸鈉緩沖溶液(500 μl)中，然后加入EDC 1 mg及sulfa-NHS 0.5 mg混勻，室溫下震蕩20 min后，加入antioxLDL抗體 200 μg，室溫下輕輕搖動3h。反應(yīng)結(jié)束后，使用超濾離心管離心除去未結(jié)合的游離抗體。純化好的anti-oxLDL-USPIO靶向探針重新懸浮于PBS中，4 ℃保存，濃度為1 mg Fe/ml。非特異性IgG-USPIO制備方法同上。采用透射電鏡檢測磁性納米顆粒的形貌，動態(tài)光散射檢測磁性納米顆粒的水合粒徑及探針穩(wěn)定性，采用酶聯(lián)免疫吸附間接法(ELISA)檢測免疫磁性納米顆粒的活性，納米探針的T2及T1弛豫時間采用7.0 T micro-MRI進行檢測。

1.2.2 ApoE-/-小鼠套管法頸動脈粥樣硬化模型建立

SPF級apoE-/-小鼠(18只，8～10周齡，20.4±0.76 g)購自北京大學動物實驗中心。ApoE-/-小鼠予高脂飲食(脂肪10%，膽固醇2%，南京協(xié)同醫(yī)藥生物工程公司)喂養(yǎng)2周后, 腹腔注射10% 水合氯醛溶液(0.35 ml/100 g)麻醉后手術(shù)切開暴露左側(cè)頸總動脈, 在頸動脈距離頸動脈分叉約0.5 mm處放置套管(內(nèi)徑0.38 mm，外徑0.5 mm，長約2 mm)，并用2層絲線固定[10]。所有操作均在10倍體視顯微鏡下進行。術(shù)后待小鼠蘇醒后將其放回籠中，維持環(huán)境溫度在20～25 ℃，燈光保持開閉各12 h。所有小鼠繼續(xù)高脂飲食3周，然后行MR成像。本實驗得到東南大學醫(yī)學院實驗倫理委員會批準。

1.2.3 實驗分組

實驗動物分為anti-oxLDL-USPIO組(6只)，非特異性IgG-USPIO組(4只)，單純USPIO組(4只)，競爭性抑制組，(1 mg anti-oxLDL-USPIO與1 mg antioxLDL-Abs混合后使用，4只)，分別經(jīng)尾靜脈注入anti-oxLDL-USPIO、非特異性IgG-USPIO，單純USPIO以及anti-oxLDL-USPIO/anti-oxLDL-Abs混合物, 劑量為30 mg Fe/kg，并于注藥前、注藥后8 h及24 h進行MRI成像。

1.2.4 MR成像

采用德國Bruker 7.0 T micro-MR成像系統(tǒng)，水平掃描架內(nèi)徑16 cm，使用38 mm大鼠頭線圈。使用4 %異氟烷麻醉后把小鼠置于有機玻璃掃描床內(nèi)，利用牙套及耳桿固定鼠腦。以1.5%異氟烷:空氣混合氣體維持麻醉狀態(tài),并監(jiān)護心率、呼吸。為了使不同時間點的MR圖像可以進行匹配，MR成像以小鼠主動脈弓上緣作為起點向上進行連續(xù)掃描。掃描采用軸位T2-PD雙回波MSME(multi slices multi echo)自旋回波序列，掃描參數(shù)：TR 3058 ms，TE 65 ms/13 ms; 層厚0.5 mm，層間距 0，層數(shù) 25層，F(xiàn)OV 2.5 cm×2.5 cm，采集次數(shù) 3， 矩陣 256×256，空間最小分辨率98 μm×98 μm，掃描時間約為30 min。

1.2.5 MR數(shù)據(jù)分析

所有MR圖像放大300%后，由兩位獨立的放射科醫(yī)生目測匹配層面小鼠頸動脈血管信號改變并確定不同時間點(注入藥物前、注入藥物后8 h和24 h)匹配的MR圖像組。通過比較匹配的MR圖像上注入探針前、后頸動脈粥樣硬化斑塊信號的改變，畫出感興趣區(qū)(ROI)。采用Bruker 7.0 T自帶的paravision 5.0軟件測量不同時間點相同層面血管斑塊信號改變區(qū)的MR信號強度(SIplaque)，并與相鄰肌肉的MR信號強度(SImuscle)進行比較，計算相對信號強度(relative signal intensity, rSI)[3,11]。采用相對信號強度改變率(relative signal intensity changes, rSIC)評估注藥后不同時間點頸動脈粥樣硬化斑塊ROI區(qū)相對信號強度的改變率。

表1 不同USPIO探針的物理特征Table 1 The physical properties of various USPIO nanoparticles

計算公式為：

rSIn表示為注藥后不同時間點的ROI相對信號強度，rSIpre為注藥前ROI的相對信號強度。

1.2.6 頸動脈標本的處理與測定

MR掃描結(jié)束后，小鼠腹腔過量麻醉。非直視下心臟取血后，開胸，充分暴露心臟，左心室灌注PBS 50～100 ml后，中性福爾馬林原位固定10～15 min。體視顯微鏡下取出左側(cè)頸動脈，取材長度為左側(cè)頸動脈分叉水平到套管下方5 mm處，小心剝離頸動脈外套管后，OCT包埋，冰凍切片機切片，厚度約6 μm。以頸動脈分叉為起點，每個頸動脈切10～12層，每層間隔500 μm，與MR圖像進行匹配，常規(guī)HE染色。

1.2.7 免疫組化分析

使用CD68(1:100, Biolegend)檢測斑塊內(nèi)巨噬細胞分布，使用anti-oxLDL-Abs (1∶100, Bioss)檢測斑塊內(nèi)oxLDL分布，染色步驟按試劑盒說明進行，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.8 普魯士藍染色

將冰凍切片用PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛固定20 min，普魯士藍反應(yīng)液(等體積10%鹽酸水溶液與10%亞鐵氰化鉀臨時混合)孵育10 min，蒸餾水洗滌3次，0.5%核固紅復染3 min，再蒸餾水洗滌3次，置正置相差顯微鏡下觀察鐵染色情況。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

圖1 anti-oxLDL-USPIO透射電鏡圖像Fig 1 TEM photograph of anti-oxLDL-USPIO nanoparticle.

2 結(jié)果

2.1 探針特征

磁性納米探針的物理特性見表1。合成好的antioxLDL-USPIO呈淡黃色，澄清，無明顯沉淀，透射掃描電鏡顯示anti-oxLDL-USPIO靶向磁性納米顆粒呈細顆粒狀外觀，大小均一，粒徑大小為11.8±1.5 nm，散在分布(圖1)；ELISA結(jié)果顯示，anti-oxLDLUSPIO OD450值與單純anti-oxLDL抗體接近； antioxLDL-USPIO煮沸后及單純USPIO的OD450值明顯降低，與單純anti-oxLDL-USPIO比較有統(tǒng)計學差異，P＜0.05(圖2)。

2.2 MR成像

尾靜脈分別注入anti-oxLDL-USPIO、IgGUSPIO、單純USPIO及anti-oxLDL-USPIO/antioxLDL-Abs混合物前、注入后8 h、24 h行MR成像，所有動物生存質(zhì)量良好，未見明顯毒性作用。共獲得66組(198副)不同時間點匹配的MR圖像進入信號強度分析，每只動物提供3～6個可用的MR圖像組。注入探針前，各組動物頸動脈粥樣硬化斑塊在MR T2WI圖像上顯示為管壁信號不均勻增高，管壁增厚，管腔狹窄，平均相對信號強度分別為

圖2 ELISA結(jié)果顯示靶向探針的生物學活性Fig 2 ELISA results showed the activity of pure antibody, anti-oxLDL-USPIOs, unconjugated USPIOs and boiled anti-oxLDL-USPIOs on OD450 values.

圖3 不同時間點ApoE-/-鼠頸動粥樣硬化斑塊T2WI圖像。3A～3C分別為注入anti-oxLDL-USPIO前、注入后8 h、24 h MR T2WI圖像。3D為病理圖片(普魯士藍染色)顯示斑塊內(nèi)見鐵沉積Fig 3 T2-weighted images at pre-, 8 h and 24 h post injection of anti-oxLDL-USPIO (A-C).The Prussian blue stain (D) showed the USPIO was deposited in the plaque.

2 2.14±0.55 (n=24)、2.63±0.69 (n=16)、2.49±0.69(n=16) 和1.97±0.87 (n=10)， 各組間比較無顯著性差異，P＞0.05。注入anti-oxLDL-USPIO后8 h及24 h后，與注藥前比較，信號改變率達-30.4±16%、-34.7±19%，與注藥前比較P值均小于0.01，普魯士藍染色顯示頸動脈斑塊信號減低區(qū)有大量鐵顆粒沉積(圖3)；非特異性IgG-USPIO組8 h及24 h頸動脈粥樣硬化斑塊相對信號改變率分別為4.2±17.4%和-4.8±15.8%，與注藥前比較，P值分別為0.495和0.121；單純USPIO組8 h及24 h頸動脈粥樣硬化斑塊相對信號改變率分別為-0.01±27.6%、1.39±19.0%，與注藥前比較，P值分別為0.775和0.812；競爭性抑制組8 h及24 h頸動脈粥樣硬化斑塊相對信號改變率分別為-6.9±17.5% 和-8.2±16.1%，與注藥前比較，P值分別為0.595和0.12。普魯士藍染色顯示頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)僅見少量的點狀鐵顆粒沉積，各時間點與anti-oxLDL-USPIO組比較均有統(tǒng)計學差異，P＜0.05(圖4)。

2.3 病理及免疫組化分析

圖5 頸動脈粥樣硬化斑塊病理及免疫組化染色。5A～5C分別為普魯士藍染色，oxLDL及CD68免疫組化染色，黃色箭頭顯示經(jīng)動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的鐵沉積。L顯示為頸動脈內(nèi)腔Fig 5 History and immunohistochemistry of carotid atherosclerosis lesions.Prussian blue stain(A) and Immunohistochemistry stain of oxLDL (B) and CD68 (C), yellow arrows show the iron deposition.L indicates the lumen of carotid.

Anti-oxLDL-USPIO探針組小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊相同層面分別行普魯士藍染色、oxLDL 及CD68免疫組化染色，結(jié)果顯示，普魯士藍染色片上藍染顆粒與oxLDL、CD68棕色顆粒分布基本一致(圖5)。

3 討論

本研究以聚乙二醇(PEG)包被的USPIO納米顆粒作為成像載體，通過EDC/sulfa-NHS方法，構(gòu)建antioxLDL-USPIO靶向探針，其水合粒徑約為30 nm，在PBS溶液中具有良好的穩(wěn)定性及生物學活性。與巨噬細胞被動靶向的葡聚糖包被的USPIO比較[12,13]，本實驗中所用的PEG包被的USPIO具有能夠降低血漿蛋白結(jié)合率，減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除率，增加循環(huán)時間的優(yōu)點，因而更適用于動脈粥樣硬化斑塊的分子影像學研究[14]。小鼠活體MRI顯示，注入anti-oxLDLUSPIO探針后8 h，apoE-/-小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊局部信號即可看到減低，24 h后信號減低更為明顯，普魯士藍染色證實信號減低區(qū)內(nèi)有大量USPIO顆粒沉積，與oxLDL及CD68免疫組化陽性區(qū)域一致；在競爭性抑制組，小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊信號在8 h及24 h僅輕度降低，與靶向探針組比較差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05，其原因與游離的anti-oxLDL抗體可能與靶向探針競爭性結(jié)合特定作用位點有關(guān)；注入非特異性IgG-USPIO及單純USPIO后，小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊信號輕度減低；病理及免疫組化結(jié)果顯示anti-oxLDL-USPIO主要在oxLDL含量豐富的巨噬細胞內(nèi)沉積。小鼠體內(nèi)研究結(jié)果及免疫組化證實，anti-oxLDL-USPIO可以作為oxLDL 特異性靶向分子影像成像載體，可以無創(chuàng)、活體檢測動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)oxLDL及巨噬細胞的分布。

OxLDL在動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展中起主要作用，是導致不穩(wěn)定斑塊發(fā)生的重要因素[15,16]。OxLDL可以導致斑塊內(nèi)的巨噬細胞和平滑肌細胞轉(zhuǎn)化為泡沫細胞，促進血管平滑肌細胞的增生與移行，引起內(nèi)皮細胞凋亡，啟動瀑布效應(yīng)，促進血栓形成。在分子水平，oxLDL可以促進多種粘附分子、熱休克蛋白的表達上調(diào)，抑制NO和前列腺環(huán)素的產(chǎn)生，并誘導多種促炎癥細胞因子和生長因子的表達。OxLDL是一種復雜抗原，其組成成分如載脂蛋白(apoB100)、磷脂、脂肪酸等均可以發(fā)生氧化反應(yīng)，這些氧化位點可以產(chǎn)生多種單克隆抗體，如MDA2[17]、IK17[18]、E06等。Torzewski等[19]使用I125-MDA2抗體檢測兔主動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的oxLDL的分布，研究進一步顯示，使用他汀類藥物干預后，斑塊內(nèi)的I125-MDA2核素濃聚明顯減低；Briley-Saebo等[20]使用E06、MDA2和IK17抗體接載釓劑微球構(gòu)建oxLDL氧化特異性表位的MR分子探針，研究結(jié)果表明，主動脈粥樣硬化apoE-/-小鼠尾靜脈注入MDA2-釓劑微球、E06釓劑微球、IK17釓劑微球后24～72 h后，主動脈粥樣硬化斑塊信號明顯增加，72h最為明顯，其強化率達到125%、137%和231%；使用游離的MDA2抗體與MDA2-釓劑微球競爭oxLDL氧化特異性表位后，其血管信號強化明顯減低；非特異性IgG-釓劑微球未見明顯信號改變。隨后，Briley-Saebo等[21]又使用E06、MDA2和IK17抗體接在脂質(zhì)體包裹的USPIO上，構(gòu)建抗體-USPIO靶向探針，研究發(fā)現(xiàn)，apoE-/-小鼠經(jīng)過眼眶靜脈注入抗體-USPIO靶向探針后24 h，主動脈粥樣硬化斑塊T2值減少，以E06-USPIO組T2值減少最為明顯，與釓劑微球?qū)嶒灲Y(jié)果相仿。這兩個實驗表明，盡管都是用oxLDL靶向單克隆抗體，但是MDA2、IK17靶向探針與E06靶向探針在動脈粥樣硬化斑塊的顯示效果存在一定差別，提示oxLDL單克隆抗體不能充分反映斑塊內(nèi)的oxLDL分布的狀況。本實驗以oxLDL多克隆抗體作為斑塊內(nèi)的oxLDL識別抗體，在8 h即可以看到斑塊信號的降低，使用過量的游離anti-oxLDL抗體進行競爭性抑制后，斑塊信號降低程度明顯減弱。針對oxLDL這樣一種復雜抗原，本研究為oxLDL靶向分子影像提供了新的研究策略。

本研究也存在一些問題。首先，各組的動物數(shù)量相對較少，大樣本的動物實驗研究更具有說服力。其次，本實驗中使用的USPIO的劑量相對過高。對探針進行改良，使其保持探針特異性的同時并能改善其藥物代謝動力學特征是本實驗下一步研究的方向。最后，本實驗所用的納米材料的生物安全性還有待進一步評估。

總之，本研究合成了oxLDL靶向的USPIO納米探針，可在活體MR上檢測測apoE-/-小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的oxLDL分布，其分布區(qū)與斑塊內(nèi)oxLDL表達區(qū)及巨噬細胞浸潤區(qū)呈正相關(guān)。AntioxLDL-USPIO可以在24 h內(nèi)特異性顯示頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的oxLDL分布，有助于不穩(wěn)定粥樣硬化斑塊的早期檢測及藥物療效評估。

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