張 萍，金建平

（蕪湖市食品藥品檢驗(yàn)所，安徽 蕪湖241000）

明目地黃丸是由熟地黃、山茱萸（制）、牡丹皮、山藥、茯苓等12味中藥組方而成的復(fù)方制劑組成，輔料為煉蜜。主要功能為滋腎、養(yǎng)肝、明目。對其進(jìn)行微生物限度檢查時，按照規(guī)定［1－2］必須進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)，但在中國藥典收載的該品種檢查項(xiàng)下，未詳細(xì)規(guī)定具體的微生物限度檢查方法。根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2010年版一部附錄）微生物限度檢查法［2］，對明目地黃丸的細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法及控制菌的檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證。通過試驗(yàn)建立了該品種的微生物限度檢查方法，為藥品生產(chǎn)和檢驗(yàn)監(jiān)督提供了一個可行有效的方法學(xué)參考。

1 實(shí)驗(yàn)環(huán)境及材料

1.1 試驗(yàn)環(huán)境

在環(huán)境潔凈度萬級、局部潔凈度百級的單向流空氣的無菌室中進(jìn)行。

1.2 儀器

HH·B11·500型電熱恒溫培養(yǎng)箱、XL21型霉菌培養(yǎng)箱、數(shù)顯恒溫水浴鍋、YXQLS－50S數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌器、電子天平。

1.3 驗(yàn)證用菌種

大腸埃希菌［CMCC（B）44 102］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26 003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63 501］、白色念珠菌［CMCC（F）98 001］、黑曲霉［CMCC（F）98 003］。以上菌種均購自中國藥品生物制品檢定所，實(shí)驗(yàn)用菌種為其第二代培養(yǎng)物。

1.4 培養(yǎng)基及稀釋劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：080519）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：080313）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號：080527）、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基（批號：090105）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號：090226）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號：080414），以上培養(yǎng)基均購自中國藥品生物制品檢定所。pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液（批號：090205），購自中國藥品生物制品檢定所、0.9%氯化鈉溶液（自配）。

1.5 樣品

明目地黃丸（蕪湖綠葉制藥有限公司，批號：100236）

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備［2，3］

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18h，用0.9%無菌氯化鈉溶液分別稀釋制成1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。取25℃培養(yǎng)7d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子。吸取出1mL孢子懸液，然后用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。

2.2 供試液制備［2］

取明目地黃丸（批號：100236）3份各10g，加45℃pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液100mL，振搖溶解，作為1：10的供試液，備用。

2.3 細(xì)菌、霉菌和酵母菌檢查法的驗(yàn)證試驗(yàn)［2］

采用《中華人民共和國藥典》（2010年版一部附錄）微生物限度檢查法項(xiàng)下方法：細(xì)菌、霉菌和酵母菌用常規(guī)法進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)。菌液組：取1mL含50～100cfu試驗(yàn)菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）的菌懸液，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，其中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，35℃，3天培養(yǎng)；白色念珠菌、黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，25℃，5天培養(yǎng)。每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿，測定所加試驗(yàn)菌數(shù)，觀察并記錄菌落數(shù)，菌落計數(shù)見表1。

試驗(yàn)組：分別取試驗(yàn)用的1：10供試液1mL和1mL含50～100cfu試驗(yàn)菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）的菌懸液，分別注入平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，35℃，3天培養(yǎng)；分別取試驗(yàn)用的1：10供試液1mL和1mL含50～100cfu試驗(yàn)菌（白色念珠菌、黑曲霉）的菌懸液，分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，25℃，5天培養(yǎng)。每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿，觀察并記錄菌落數(shù)，菌落計數(shù)見表2。

表1 菌液組菌落計數(shù) （cfu／mL）

表2 試驗(yàn)組菌落計數(shù) （cfu／mL）

供試品對照組：取1：10明目地黃丸供試液1mL，加入平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)3天；取1：10明目地黃丸供試液1mL，加入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)5天，每個稀釋級供試液平行制備2個平皿，按《中國藥典》2010年版一部微生物限度菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。菌落計數(shù)見表3，試驗(yàn)組菌的回收率見表4。

表3 供試品對照組菌落計數(shù) （cfu／mL）

回收率計算：

表4 試驗(yàn)組菌的回收率 （%）

稀釋劑對照組：取pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液1mL和1mL含50～100cfu試驗(yàn)菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）的菌懸液，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，其中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，35℃，3天培養(yǎng)；白色念珠菌、黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，25℃，5天培養(yǎng)。每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿，觀察并記錄菌落數(shù)，見表5，稀釋劑對照組菌的回收率見表6。

表5 稀釋劑對照組菌落計數(shù) （cfu／mL）

回收率計算：

表6 稀釋劑對照組菌的回收率 （%）

表4、表6數(shù)據(jù)表明，采用常規(guī)法進(jìn)行計數(shù)時，試驗(yàn)組和稀釋劑組的5種陽性試驗(yàn)菌株的回收率均大于70%。

2.4 控制菌檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn)

2.4.1 大腸埃希菌驗(yàn)證［2］

采用《中華人民共和國藥典》（2010年版一部附錄）微生物限度檢查法項(xiàng)下方法：大腸埃希菌用常規(guī)法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。①試驗(yàn)組：取1∶10的供試液10mL及10～100cfu試驗(yàn)菌加入到100mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法檢查；②陽性菌對照試驗(yàn)：取56cfu的陽性對照菌大腸埃希菌加入到100mL膽鹽乳糖增菌液中，依相應(yīng)控制菌檢查法檢查；③陰性菌對照組：取1∶10的供試液10mL及陰性對照菌金黃色葡萄球菌70cfu，加入到100mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法檢查；④陰性對照試驗(yàn)：取稀釋劑10mL加入到100mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)；⑤供試品組：取1∶10的供試液10mL加入到100mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。

取上述各組培養(yǎng)物0.2mL，接種至含5mL MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)，于5h、24h在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照，觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液觀察。結(jié)果見表7（表中“＋”表示反應(yīng)呈陽性，“－”表示反應(yīng)呈陰性）。

表7 大腸埃希菌驗(yàn)證結(jié)果

2.4.2 大腸菌群的驗(yàn)證［2］

①陽性菌對照組：取1mL含菌量為10～100cfu／mL的大腸埃希菌對照菌液加入到10mL乳糖膽鹽發(fā)酵管中，于35℃培養(yǎng)24h；②供試品組：取1mL 1：10的杞菊地黃丸（濃縮丸）供試液加入到10mL乳糖膽鹽發(fā)酵管中，于35℃培養(yǎng)24h；③試驗(yàn)組：取含菌量為10～100cfu／mL的大腸埃希菌對照菌液1mL和1mL 1：10的供試液加入到10mL乳糖膽鹽發(fā)酵管中，于35℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)果見表8。

表8 大腸菌群驗(yàn)證結(jié)果

結(jié)果顯示，陽性菌生長良好，表明供試品在該實(shí)驗(yàn)條件下對大腸菌群的代表菌大腸埃希菌無抑菌作用，說明可以采用此方法進(jìn)行本品的大腸菌群檢查。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

3.1 細(xì)菌數(shù)、霉菌、酵母菌計數(shù)及驗(yàn)證結(jié)果

由表4及表6的驗(yàn)證結(jié)果可以看出，試驗(yàn)組菌的回收率和稀釋劑對照組菌的回收率均大于70%，說明可以采用常規(guī)的平皿計數(shù)法進(jìn)行明目地黃丸的細(xì)菌、霉菌及酵母菌限度檢查，方法符合《中國藥典》2010年版一部的相關(guān)要求。

3.2 控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

試驗(yàn)組、陽性菌對照組均呈陽性，陰性菌對照組未檢出金黃色葡萄球菌。試驗(yàn)組呈陽性表明試驗(yàn)菌能夠正常生長，陰性菌對照組未檢出陰性菌，表明試驗(yàn)菌對其相對應(yīng)的增菌液具有專屬性并且供試品在上述實(shí)驗(yàn)條件下對大腸埃希菌無抑菌作用。因此，明目地黃丸控制菌檢查可采用常規(guī)法。

3.3 微生物限度檢查方法的建立

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，明目地黃丸微生物限度檢查方法為：照微生物限度檢查法（《中國藥典》2010年版一部附錄），取本品10g，加入45℃的pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，振搖使分散均勻，作為1∶10供試液。細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)按常規(guī)平皿法測定；控制菌按常規(guī)法檢查，結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定。

［1］國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄70－79.

［2］國家藥典委員會.中國藥典［S］.二部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：附錄79－88.

［3］馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊［M］.第1版.北京：科學(xué)出版社，2000：62.