石會(huì)娜，栗海波，劉 偉

鄭州大學(xué)生物工程系鄭州450001

(2011-01-14收稿 責(zé)任編輯 徐春燕)

2009年3月以來，一種新的H1N1流感病毒的暴發(fā)引起了全球越來越多的關(guān)注。世界衛(wèi)生組織推薦奧司他韋為最為有效的抗病毒藥物。然而，截止到2010年2月，世界衛(wèi)生組織宣布已有200多例H1N1病例對(duì)奧司他韋產(chǎn)生抗藥性［1］。神經(jīng)氨酸酶(NA)在流感病毒復(fù)制、釋放和致病過程中起著非常重要的作用。奧司他韋是NA的抑制劑，能夠有效阻止流感病毒NA發(fā)揮以上功能，從而達(dá)到較好的治療效果。甲型流感病毒NA活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)在所有類中都是保守的，但是活性位點(diǎn)氨基酸殘基的改變有可能使病毒對(duì)奧司他韋產(chǎn)生抗藥性［2］。作者在GenBank中發(fā)現(xiàn)一株新H1N1流感病毒的NA活性位點(diǎn)151位由天冬氨酸突變成了甘氨酸(D151G)，并通過分子動(dòng)力學(xué)方法觀察了該流感病毒株對(duì)奧司他韋的抗藥性，再利用分子對(duì)接方法篩選出對(duì)這一病毒株的NA具有較強(qiáng)抑制作用的候選化合物。

1 材料與方法

1.1 分子動(dòng)力學(xué)模擬

D151G突變株NA氨基酸序列由GenBank獲得(序列號(hào):GQ369413.1)，其結(jié)構(gòu)是以野生型禽流感H5N1病毒NA和奧司他韋復(fù)合物(WT-OTV)的晶體結(jié)構(gòu)(PDB Code:2HU4)為模板通過同源建模得到，兩者氨基酸序列相似性為90.4%，然后再將WT-OTV和D151G突變株NA的結(jié)構(gòu)疊加，刪除掉WT-OTV的NA后就得到了D151G突變株NA與奧司他韋復(fù)合物(MT-OTV)的結(jié)構(gòu)。

分別用WT-OTV和MT-OTV的結(jié)構(gòu)作為初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。蛋白質(zhì)的力場采用ff99力場［3］，小分子的力場采用 gaff力場［4］。利用Gaussian 03軟件［5］的 HF/6-31G*方法優(yōu)化小分子的結(jié)構(gòu)，再應(yīng)用antechamber程序產(chǎn)生gaff力場中缺失的小分子參數(shù)。復(fù)合物模型在進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬前還需要利用Xleap程序?qū)?fù)合物進(jìn)行處理，包括增加氫原子、增加抗衡離子(Na+)以使體系中性化和增加8.5?厚的基于TIP3P模型的八面體水環(huán)境。

分子動(dòng)力學(xué)過程優(yōu)化分為兩階段:首先約束溶質(zhì)，對(duì)溶劑分子進(jìn)行優(yōu)化;再無約束優(yōu)化整個(gè)系統(tǒng)。每個(gè)階段均采用最陡下降法優(yōu)化2 500步，再采用共軛梯度法優(yōu)化2 500步。優(yōu)化之后用60 ps時(shí)間使系統(tǒng)升溫到298 K，在298 K下進(jìn)行500 ps的無約束的動(dòng)力學(xué)平衡，平衡之后再進(jìn)行500 ps的分子動(dòng)力學(xué)模擬，用MM-GBSA方法計(jì)算結(jié)合能。

1.2 藥物篩選 從ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc.docking.org/)里篩選出和奧司他韋相似度為70%的小分子化合物，然后把這些小分子分別和D151G突變株的NA組成復(fù)合物，再采用Autodock 4.0程序［6］對(duì)這些復(fù)合物進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接選用的格點(diǎn)盒子大小為40點(diǎn)×40點(diǎn)×40點(diǎn)，格點(diǎn)間距0.375?。運(yùn)用Lamarckian遺傳算法［6］，對(duì)小分子進(jìn)行100次的獨(dú)立對(duì)接實(shí)驗(yàn)，能量極大值設(shè)為2 500 000，最大變異代數(shù)設(shè)為27 000，最后依據(jù)復(fù)合物的最低結(jié)合能來挑選出比MT-OTV結(jié)合能更小的小分子。

2 結(jié)果與討論

利用MM-GBSA方法計(jì)算出的各項(xiàng)能量值如表1所示，WT-OTV的結(jié)合能為 -14.0 kcal/mol(1 kcal=4.184 kJ)，而實(shí)驗(yàn)值為 -13.0 kcal/mol［7］，由此可以看出此種方法得到的結(jié)合能跟實(shí)驗(yàn)值非常吻合。

表1 MM-GBSA計(jì)算所得到的能量值 kcal/mol

MT-OTV的結(jié)合能比 WT-OTV降低了-4.61 kcal/mol，實(shí)驗(yàn)［8］已證實(shí) H274Y 突變流感病毒株對(duì)奧司他韋的敏感性比野生型流感病毒降低了1 466倍，而H274Y突變株的NA與奧司他韋預(yù)測的結(jié)合能為 -9.8 kcal/mol［9］，由此可以看出 D151G 突變流感病毒株對(duì)奧司他韋也將表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗藥性。

從ZINC數(shù)據(jù)庫里篩選出了21個(gè)和奧司他韋相似度為70%的小分子化合物，經(jīng)Autodock 4.0軟件計(jì)算，有5個(gè)化合物與D151G突變的NA的結(jié)合能比與奧司他韋的結(jié)合能小。這5個(gè)化合物和奧司他韋的結(jié)構(gòu)以及計(jì)算結(jié)合能如圖1所示，其中，4-［1-(1-金剛烷基氧化羧基)乙氨基］-3-氨基-4-氧代-丁酸與 D151G突變株 NA的結(jié)合能力最強(qiáng)，對(duì)D151G突變流感病毒株具有較強(qiáng)的抑制作用。

圖1 5種化合物和奧司他韋的結(jié)構(gòu)式及計(jì)算結(jié)合能A:奧司他韋;B:3-氨基-4-氧代-4(1-茚酮-2-基)氨基丁酸;C:3-氨基-4-(4-甲基-2-氧代苯并吡喃-7-基)氨基-4-氧代丁酸;D:C的異構(gòu)體;E:2-［2-氨基-3-(4-羥苯基)-丙醇］氨基-3-甲基-戊酸;F:4-［1-(1-金剛烷基氧化羧基)乙氨基］-3-氨基-4-氧代-丁酸。

總之，D151G突變流感病毒株對(duì)奧司他韋具有抗藥性;利用分子對(duì)接軟件從ZINC小分子數(shù)據(jù)庫中篩選出的5個(gè)小分子化合物中4-［1-(1-金剛烷基氧化羧基)乙氨基］-3-氨基-4-氧代-丁酸的結(jié)合能力最強(qiáng)，是較理想的藥物候選化合物。

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