黃 梅 楊麗娟 謝 丹

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺科，廣東省廣州市機(jī)場路16號(hào)大院，510405)

三苯氧胺(TAM)是乳腺癌內(nèi)分泌治療最重要的藥物之一，應(yīng)用三苯氧胺對雌激素受體陽性乳腺癌患者進(jìn)行抗雌激素治療，獲益率約為60%，能減少復(fù)發(fā)率和提高生存率［1］。但是臨床有40%左右雌激素受體陽性乳腺癌患者不能獲益，有相當(dāng)部分患者最初TAM治療有效，但是最后因獲得性的TAM耐藥導(dǎo)致治療失敗。TAM耐藥是目前乳腺癌研究的熱點(diǎn)之一。本研究采用活血化瘀中藥三七總皂苷和TAM聯(lián)合應(yīng)用于乳腺癌T47D細(xì)胞系，探索三七對TAM有無協(xié)同增效作用，從而為三七參與乳腺癌的內(nèi)分泌治療提供依據(jù)，為提高三苯氧胺臨床療效開辟新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人乳腺癌T47D細(xì)胞株購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫;RPMI1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶:美國Gibco公司;胎牛血清:美國Hyclone公司;0.25%胰酶:美國 Gibco公司;二甲基亞砜:美國Sigma公司;MTT:美國Sigma公司;實(shí)驗(yàn)用試劑(Cell cycle staining buffer):杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司;三苯氧胺系美國Sigma公司產(chǎn)品;三七總皂苷:四川杰象藥物原料有限公司;全自動(dòng)酶標(biāo)儀:美國Bio.tad公司;流式細(xì)胞儀:Beckman公司。

1.2 常用工作液的配制 1)磷酸緩沖液的配制:稱取KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO4·12H20 2.89g，混合溶解于1000mL的雙蒸水中，并調(diào)定 pH 7.2～7.4。2)細(xì)胞培養(yǎng)液配制:高糖DMEM+10%胎牛血清+200mL/40U胰島素。3)三七母液配制:三七總皂苷162.5mg+16mL細(xì)胞培養(yǎng)液可以得到104μg/mL母液。4)三苯氧胺母液配制:取三苯氧胺10mg溶于17.742mL無水乙醇中即可得10－3mol/L母液。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將T47D細(xì)胞培養(yǎng)于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、100%濕度、5%(體積分?jǐn)?shù))的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白細(xì)胞對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組又分為不同濃度的單藥組和聯(lián)合用藥組，其中TAM 按濃度不同分為 1.5 ×10－5mol/L、1.5 ×10－6mol/L、1.5×10－7mol/L 3個(gè)亞組;三七總皂苷按劑量不同分為 800μg/mL、1000μg/mL、1600 μg/mL 3 個(gè)亞組;聯(lián)合用藥組按單藥濃度的不同進(jìn)行組合。

1.5 MTT比色分析法 濃度為每毫升5×104個(gè)T47D細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200μL，每組6孔。藥物作用68h后加5g/L MTT液每孔20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜200μL，震蕩10min，在自動(dòng)酶標(biāo)儀(波長570nm)上進(jìn)行比色，自動(dòng)記錄每孔吸光度(A)。計(jì)算不同濃度藥物單用或合用對T47D細(xì)胞株的生長抑制率。

抑制率(%)=(對照組平均A值一實(shí)驗(yàn)組平均A值)/對照組平均A值×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞周期和凋亡率 胰酶消化藥物作用24h、48h、72h的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，用碘化丙啶(PI)染色，4℃冰箱保存，30min后用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期和凋亡率。每份標(biāo)本記數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，用隨機(jī)所附軟件對測量值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的TAM及三七總皂苷單藥或聯(lián)用對T47D細(xì)胞生長抑制的影響 研究表明，TAM及三七總皂苷均可有效抑制乳腺癌T47D細(xì)胞生長，抑制作用隨濃度增加和時(shí)間延長而增強(qiáng)，單藥運(yùn)用以三七總皂苷1600μg/mL作用72h抑制作用最明顯，其次是TAM 1.5×10－5mol/L濃度作用72h;聯(lián)合用藥同樣可以有效抑制乳腺癌T47D細(xì)胞生長，但不是所有的聯(lián)合方案與單藥運(yùn)用相比都有優(yōu)勢。高濃度三苯氧胺(1.5×10－5mol/L)與3種濃度三七總皂苷聯(lián)合與單藥應(yīng)用相比均可顯示出明顯的抑制優(yōu)勢;同樣，高濃度三七總皂苷(1600 μg/mL)與三苯氧胺聯(lián)合亦顯現(xiàn)出類似優(yōu)勢。抑制效果最好的方案是T3+S3作用72h。詳見表 1(T1:TAM1.5×10－7mol/L;T2:TAM1.5×10－6mol/L;TAM1.5 × 10－5mol/L;S1:三七總皂苷800μg/mL;S2:三七總皂苷 1000μg/mL;S3:三七總皂苷1600μg/mL)。

表1 不同濃度的TAM及三七總皂苷單藥或聯(lián)用對T47D細(xì)胞生長抑制的影響

表2 不同濃度、時(shí)間TAM及三七總皂苷單藥或合用T47D細(xì)胞細(xì)胞周期分布情況(%，s)

表2 不同濃度、時(shí)間TAM及三七總皂苷單藥或合用T47D細(xì)胞細(xì)胞周期分布情況(%，s)

注:與空白組比較，△P＜0.05;與T1比較，▲P＜0.05;與T1+S2比較，*P＜0.05。

藥物分組細(xì)胞周期分布G0/G1期細(xì)胞S期細(xì)胞G2/M期細(xì)胞24h 48h 72h T1 63.5±3.0* 66.7±3.0 69.0±2.0 34.0±1.3△ 35.0±1.5△ 30.2±1.5△ 4.9±0.2△ 3.8±0.4△ 2.9±0.1 24h 48h 72h 24h 48h 72h△T2 76.1±3.1△＊▲ 77.1±3.2△＊▲75.1±2.6△＊▲ 49.8±1.6 45.1±2.1 28.9±1.1△ 8.1±0.6 7.0±0.8 6.1±0.5△S1 68.6±2.5△＊▲ 64.2±2.6 62.1±1.8 47.2±2.1 33.0±1.5△▲ 32.0±1.2△ 8.0±0.5 1.8±0.2△▲ 1.0±0.07△▲S2 62.5±1.6* 65.8±1.4 63.8±1.9 35.1±2.0△ 42.0±2.0△ 35.1±2.0△ 2.4±0.1△＊▲ 5.7±0.4△ 3.7±0.2△T1+S1 61.7±2.5* 60.0±1.3 62.2±1.7 36.5±1.6△＊▲ 27.0±0.6△▲ 28.7±2.1△ 4.1±0.9△▲ 2.1±0.3△▲ 1.6±0.05△T1+S2 58.6±2.0 67.7±2.0 70.9±3.0 28.3±1.2△ 27.8±1.2△▲ 25.9±1.6△▲ 2.9±0.3△＊ 1.5±0.2△▲ 1.3±0.08△▲T2+S1 68.3±2.7△＊▲ 70.1±2.1 67.1±2.3 47.0±1.9 45.9±2.5 29.0±2.3△ 5.2±1.0△ 4.9±0.5△ 1.3±0.3△▲T2+S2 58.7±2.1 63.2±2.7 68.5±2.5 35.2±1.2△ 32.3±1.0△▲ 38.5±2.7△ 3.8±0.3△＊ 3.7±0.4△ 4.5±0.8△空白組 64.9±1.7 66.83±2.1 67.2±2.6 47.2±1.5 48.1±1.2 48.3±0.5 7.2±0.8 7.01±1.0 8.3±0.5

2.2 不同濃度及作用時(shí)間的TAM及三七總皂苷單藥或合用對T47D細(xì)胞周期的影響 TAM及三七總皂苷單藥或聯(lián)用一定程度上可影響T47D細(xì)胞株的細(xì)胞周期進(jìn)程，與空白對照組相比主要表現(xiàn)在提高G0/G1期細(xì)胞比例、降低S期及G2/M期細(xì)胞比例。聯(lián)合用藥與單藥相比在對G0/G1期細(xì)胞影響方面未顯示出明顯優(yōu)勢，其優(yōu)勢主要表現(xiàn)在能夠顯著降低降低S期及G2/M期細(xì)胞比例，見表2。

2.3 不同濃度、時(shí)間TAM及三七總皂苷單藥或合用T47D細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況 TAM及三七總皂苷單藥或聯(lián)用均可加速T47D細(xì)胞株凋亡，并且顯示出時(shí)間及濃度依賴。聯(lián)合用藥較單藥應(yīng)用顯示出明顯誘導(dǎo)凋亡優(yōu)勢，其中以T1+S1效果最突出。詳見表3(T1:TAM1.5 ×10－5mol/L;T2:TAM1.5 ×10－6mol/L;S1:三七總皂苷1600μg/mL;S2:三七總皂苷1000μg/mL)。

表3 不同濃度、時(shí)間TAM及三七總皂苷單藥或合用T47D細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況(%，s)

表3 不同濃度、時(shí)間TAM及三七總皂苷單藥或合用T47D細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況(%，s)

注:與空白組比較，△P＜0.05;與T1比較，▲P＜0.05;與S1比較，*P＜0.05。

藥物分組 凋亡率24h 48h 72h T1 11.1±1.20△ 13.5±0.85△ 15.3±1.09△1.9±0.10 2.1±0.20 2.5±0.02 T2 2.3±0.30 4.7±0.30△ 8.3±0.70△S1 12.6±0.90△▲ 15.1±1.13△ 16.9±1.25△S2 3.4±0.20△ 6.1±0.35△＊ 8.5±0.60△＊T1+S1 19.6±1.05△＊▲ 21.0±0.30△＊▲ 22.2±1.35△＊▲T1+S2 15.5±0.98△＊▲ 17.0±1.02△＊▲ 19.8±1.47△＊▲T2+S1 18.0±1.02△＊▲ 18.6±1.17△＊▲ 19.7±0.85△＊▲T2+S2 5.5±0.48△ 07.8±0.50△ 10.2±0.92△空白組

3 討論

作為乳腺癌內(nèi)分泌治療最重要的藥物之一，三苯氧胺取得了良好的臨床療效，但長期應(yīng)用也產(chǎn)生了一系列問題，例如毒副反應(yīng)、耐藥導(dǎo)致治療失敗等。因此，如何減少毒副反應(yīng)，減少耐藥現(xiàn)象，提高臨床治療效果成為目前研究熱點(diǎn)。

三七又名田七，為五加科人參屬植物，是臨床常用傳統(tǒng)中藥，皂苷類成分是三七的主要生理活性成分。近年來，有不少臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)三七對肝癌、胃癌、血液病、婦科腫瘤、黑色素細(xì)胞瘤、乳腺癌等多種腫瘤具有抗腫瘤活性。三七抗腫瘤的途徑包括:直接抑制腫瘤細(xì)胞［2］、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡［3］、誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥［4］等。通過流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析顯示，TAM及三七總皂苷單藥或聯(lián)用一定程度上可影響T47D細(xì)胞株的細(xì)胞周期進(jìn)程，主要表現(xiàn)在降低S期及G2/M期細(xì)胞比例，與空白組對照，T1組、S1組及(T1+S1)組顯示出了明顯抑制優(yōu)勢，組間比較顯示，高濃度的三苯氧胺及三七總皂苷聯(lián)合運(yùn)用(T1+S1)較其他組抑制優(yōu)勢更明顯，并且顯示出一定的時(shí)間優(yōu)勢。由此可見，TAM及三七總皂苷對T47D細(xì)胞所產(chǎn)生的抑制作用是通過影響細(xì)胞周期的進(jìn)程而發(fā)揮作用。

促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前腫瘤治療方向之一，現(xiàn)在研究認(rèn)為三七總皂苷和TAM治療均可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。本次研究顯示，TAM及三七總皂苷單藥或聯(lián)用均可加速M(fèi)CF－7細(xì)胞株凋亡，并且顯示出時(shí)間及濃度依賴。聯(lián)合用藥優(yōu)勢較單藥更突出，顯示出聯(lián)合用藥具有一定的協(xié)同優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，三七總皂苷對乳腺癌細(xì)胞有直接抑制作用，該作用具有時(shí)間及濃度依賴性;高濃度三七總皂苷與TAM聯(lián)合可以增強(qiáng)TAM對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，其作用機(jī)制與影響細(xì)胞周期、協(xié)同促進(jìn)凋亡有關(guān)。二者的聯(lián)合應(yīng)用會(huì)使抗腫瘤作用增強(qiáng)，從而為乳腺癌的內(nèi)分泌治療提供了新的思路。

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［2］李元青，馬成杰，陳信義.三七活性成分抗腫瘤作用及其免疫學(xué)機(jī)制初探.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)(中醫(yī)臨床版)，2008，15(1):17－19.

［3］王國俊，周黎明，王莉.三七皂甙R1誘導(dǎo)HL260細(xì)胞凋亡的初步研究.四川生理科學(xué)雜志，2004，26(1):14.

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